目的：1研究猪苓对正常大鼠血浆醛固酮(ALD)、血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)、抗利尿激素(ADH)及心钠素(ANP)的影响,探讨猪苓多靶点利尿机制,为猪苓今后临床科学使用提供重要依据。2研究猪苓不同剂量与不同给药次数对大鼠血管紧张素转化酶(ACE)和血管紧张素Ⅱ受体1的影响,进一步探讨猪苓产生利尿作用的药理机制。3建立同时测定猪苓中麦角甾酮与麦角甾醇的液相色谱-串联质谱法,为中药猪苓提供质量控制检测方法。4建立HPLC-APCI/MS/MS法同时检测猪苓给药后大鼠血浆中麦角甾酮与麦角甾醇,并检测分析两者血药浓度变化,运用数学模型拟合,进行猪苓给药后大鼠体内药代动力学的研究。5建立液相色谱-串联质谱法测定大鼠给予猪苓低中高三剂量后,麦角甾酮与麦角甾醇在大鼠尿液中的含量,继续探讨猪苓中麦角甾酮与麦角甾醇在尿液中排泄情况。方法：1将筛选合格雄性SD大鼠60只随机分为给药2d组与给药8d组。每组分为生理盐水组(NS)、呋塞米组、猪苓(低、中、高剂量)组,每组6只。每日分别灌胃等体积生理盐水10 mL·kg-1、呋塞米0.1 g·kg-1、猪苓低剂量组18.9 g·kg-1、猪苓中剂量组56.7 g·kg-1、猪苓高剂量组94.5 g·kg-1,分别连续给药2d与8d。采用放射免疫方法检测大鼠血浆醛固酮(ALD)、血管紧张素Ⅱ (Ang Ⅱ)、抗利尿激素(ADH)与心钠素(ANP)含量。2筛选尿量、尿Na+、尿K+、尿Cl-四个指标均在正常范围内的大鼠42只,分为生理盐水组(NS)、呋塞米组、卡托普利组、氯沙坦组、猪苓低剂量组、猪苓中剂量组、猪苓高剂量组,每组大鼠6只。每日分别灌胃给予等体积生理盐水10 mL·kg-1、呋塞米0.1 g·kg-1、卡托普利0.63 g·kg-1、氯沙坦0.315 g·kg-1猪苓低剂量组18.9g·kg-1、中剂量组56.7 g·kg、猪苓高剂量组94.5 g·kg,连续灌胃给药8天,每日1次。分别于第一次给药后24 h、第2次给药后24 h、第8次给药后24 h分别眼眶静脉丛取血,并采用ELISA试剂盒进行检测。3采用超声提取方法制备供试品溶液,以Zorbax Eclipse XDB-C18(2.1 mm×150 mm,3.5 μ m)色谱柱进行分离,流动相为甲醇：10 mmoL·L-1醋酸铵缓冲液(98：2,V/V),流速0.4 mL.min-1。试样在三重四极杆串联质谱中经过大气压化学离子化(APCI)离子源,在正离子方式下采用多反应离子监测(MRM)模式进行检测。4猪苓灌胃给药并于眼底静脉丛采血,血浆样本经乙酸乙酯萃取处理,以β-蜕皮甾酮作为内标,优化相关质谱与色谱条件,建立同时检测血浆总麦角甾酮与麦角甾醇的高效液相色谱串联质谱检测方法,进行血浆样本检测分析,数据采用内标法进行定量分析,做方法学验证。药代动力学采用WinNonlin软件进行麦角甾酮与麦角甾醇模型模拟拟合,结合两者药时曲线,计算相关药代动力学参数。5筛选合格实验大鼠24只,随机分成猪苓低中高三剂量组,每组大鼠8只,于代谢笼,每组每只按2 mL·100g-1灌胃给予猪苓低中高三剂量,给药后,分别于给药后0-2、2-4、4-8、8-12、12-24、24-36、36-48、48-60 h时间段内收集尿液,采用稀释法制备尿液样本。优化高效液相串联质谱检测方法,做方法学确证,并对尿液样本进行检测分析,绘制尿药浓度-时间曲线与累计尿排量-时间曲线。结果：1与NS组相比,猪苓给药2d组与8d组均有明显利尿作用,且猪苓高剂量组利尿活性与呋塞米组作用相当；猪苓低中高三剂量组ALD、AngⅡ ADH含量均明显降低,ANP水平升高,并且猪苓给药8d组与给药2d组相比,给药8d组各指标变化水平明显高于给药2d组(P<0.05),其中,给药8 d猪苓高剂量组的ALD、ANP变化幅度最大,较NS组分别变化56.7%与69.2%；猪苓中剂量组ADH含量的降低作用较为明显,较NS组降低50.8%,而对于上述4个指标,呋塞米组给药2d和给药8d组的变化水平并不显著。2猪苓对正常大鼠血液中血管紧张素转化酶(ACE)和血管紧张素Ⅱ1型受体1(AT1)的影响2.1猪苓对血管紧张素转化酶的影响与生理盐水组相比,卡托普利组、猪苓低中高给药组大鼠血管紧张素转化酶水平明显降低,且降低水平随给药天数的增加而升高。与卡托普利组相比,给药1天后,猪苓各给药组大鼠血管紧张素转化酶降低水平低于卡托普利组；猪苓低中高三剂量组相比,降低水平相差不大；猪苓给药2天后,高剂量对大鼠血管紧张素转化酶抑制作用与卡托普利作用相当；猪苓低中高三剂量组相比,抑制作用呈一定的剂量依赖性；给药8天后,猪苓低中高三给药组抑制作用明显增加,其低剂量组与卡托普利组相比无明显差异,中高剂量抑制作用均强比卡托普利,三给药组降低水平呈一定的剂量依赖性。2.2猪苓对血管紧张素Ⅱ1型受体1的影响与生理盐水组相比,氯沙坦组与猪苓低中高剂量组大鼠血管紧张素Ⅱ受体1水平均呈降低；给药1天与给药2天后,与氯沙坦组相比,猪苓低中高给药组大鼠血管紧张素Ⅱ受体1降低水平均低于氯沙坦组；给药8天后,猪苓三剂量组大鼠血管紧张素Ⅱ受体1明显降低,并呈一定的剂量依赖性。3中药猪苓中麦角甾酮与麦角甾醇在1-3000 ng·mL-1范围内与峰面积线性关系良好,麦角甾酮和麦角甾醇的平均加样回收率分别为]00.8%和100.7%,日内和日间变异(RSD)均小于6.5%,色谱峰保留时间分别为4.2 min和4.6 min。4血浆中麦角甾酮与麦角甾醇分别在1-3000 ng·mL-1、3-3000 ng·mL-1范围内呈良好的线性关系。麦角甾酮低中高3种浓度质控样品相对回收率分别为(95.8±8.5)%、(96.0±4.4)%、(95.5±3.5)%(n=15),提取回收率分别为(68.3±9.1)%、(91.5±6.5)%、(85.5%±4.4)%(n=5)。麦角甾醇低中高3种浓度质控样品相对回收率为(97.3±7.7)%,(100.7±8.9)%, (101.4±7.5)%(n=15),提取回收率分别为(68.7±10.5)%, (90.6±13.3)%, (90.6±8.5)%, (n=5)。麦角甾酮与麦角甾醇日内精密度、日间精密度、稳定性RSD值均小于15%。大鼠灌胃给予猪苓低、中、高三剂量后,数据采用WinNonlin软件进行分析处理,数据与一级吸收的一室开放模型匹配最佳。单次灌胃给予猪苓后,随着剂量增加,麦角甾酮与麦角甾醇的药时曲线下面积、血药峰浓度及吸收速率常数均增大,中剂量组麦角甾酮与麦角甾醇达峰时间最短,其半衰期最长。高剂量组麦角甾酮的表观分布容积最大,而麦角甾醇在中剂量组中最大。低剂量组麦角甾酮平均滞留时间最长,中剂量麦角甾醇平均滞留时间最大。麦角甾酮与麦角甾醇的消除速率常数和清除率则随剂量增加而增大,呈现一定的剂量依赖性。5尿液中麦角甾酮与麦角甾醇在1-300 ng·mL-1范围内线性关系良好,两者低中高3质控样品日内精密度与日间精密度RSD值均小于10%,稳定性RSD值小于15%。麦角甾酮低中高三浓度相对回收率为(92.8±4.4)%、(98.6±7.3)%、(93.5±7.1)%(n=15),提取回收率为(90.4±4.4)%、(89.0±3.3)%、(95.7±2.7)%,(n=5),基质效应为(96.0±0.2)%, (98.9±3.0)%, (95.1±1.2)%, (n=5)。麦角甾醇低中高三浓度相对回收率为(94.8±6.2)%、(98.8±5.8)%、(99.3±6.2)%(n=15),提取回收率为(96.4±8.7)%、 (92.2±5.6)%、(93.5±2.1)%, (n=5),基质效应为(96.7±2.2)%,(99.9±4.7)%, (96.4±4.8)%, (n=5)。尿液样本分析麦角甾酮与麦角甾醇在尿液中以原型排泄在给药后18 h达到最大排泄量,给药后48-60 h时间段尿液中仍残存少量麦角甾酮与麦角甾醇,整体排泄量随中高三剂量呈明显的剂量依赖性。结论：1血浆心钠素、醛固酮、血管紧张素Ⅱ及抗利尿激素是参与调节体内水液代谢的重要因素,猪苓利尿作用可能与降低醛固酮、血浆紧张素Ⅱ及抗利尿激素含量,升高血浆心钠素水平有关,且中药猪苓起效时效长而明显,为猪苓利水渗湿传统功效与多靶点起效提供一定的科学依据。2猪苓具有显著的利尿活性,可降低血管紧张素Ⅱ、醛固酮、血管加压素水平,其作用靶点可能在于抑制血管紧张素转化酶(ACE)、拮抗血管紧张素Ⅱ受体1,从而降低肾素-血管紧张素-醛固酮系统中相关激素水平,产生强大的利尿作用。3本实验建立的HPLC-APCI-MS/MS法用时短、专属性强,可以准确、灵敏、快速地检测猪苓配方颗粒中出麦角甾酮与麦角甾醇的含量,对猪苓颗粒质量控制和评价具有一定意义,为下一步深入研究其活性成分的药理机制奠定基础。4所建高效液相质谱检测方法可高效、快速、灵敏并同时监测猪苓给药后大鼠血浆中麦角甾酮与麦角甾醇的含量,为研究猪苓药代动力学提供科学准确的检测方法。研究中单次给予中药猪苓后,其主要活性成分麦角甾酮与麦角甾醇在大鼠体内的药代动力学行为以一级动力学的房室开放模型拟合较好,更具体的对中药猪苓在大鼠体内的动力学变化情况加以详细描述,其药物动力学特征结合药代动力学参数,为临床治疗所需有效血药浓度选择最佳剂量、给药周期、负荷剂量的计算与设计最佳给药方案提供一定的参考价值。5实验所建立的HPLC-MS/MS法高效、灵敏、特异性强,各项方法学验证指标均满足检测要求,适用于中猪苓给药后大量尿液样本中麦角甾酮与麦角甾醇两利尿活性物质的检测。根据实验所建立的尿液检测方法检测各时段尿样,从平均尿药浓度-时间曲线中得出麦角甾酮与麦角甾醇在尿液中以原型排泄在给药后18 h达到最大排泄量,累计尿排量-时间曲线发现给药后48-60 h时间段尿液中仍残存少量麦角甾酮与麦角甾醇,但整体排泄量已趋于平稳,结合前期药代动力学实验结果中药猪苓给药后血浆样品中给药后12 h达到最高浓度,说明猪苓各剂量给药后,猪苓利尿活性物质在体内能够长时间作用机体,体内代谢较慢,一定程度上补充了猪苓给药后尿液检测实验数据的空白。