【摘 要】
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本研究的第一、二部分就是利用目前研究分子细胞生物学最先进的分析技术-激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy,简称LSCM)技术与近年逐渐兴起的绿色荧光
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本研究的第一、二部分就是利用目前研究分子细胞生物学最先进的分析技术-激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy,简称LSCM)技术与近年逐渐兴起的绿色荧光蛋白标记法,来特异性地揭示膜磷脂PIP<,2>的正常的,以及在不同的药理性阻断剂作用下的代谢过程,为进一步研究PIP<,2>与离子通道的相互作用提供时间和空间上的基础.本研究的第三,四部分将分别以非洲爪蟾卵母细胞和中国仓鼠软巢(CHO)细胞株为表达系统,表达不同类型的Kir2.0亚家族钾通道,研究胆固醇和AA对这些通道的特异性作用以及PIP<,2>与这种作用关系.一、动态观察不同的药理性阻断剂对膜磷脂PtdIns(4,5)P<,2>的代谢过程的影响特征.结论:PLC<,δ1>PH-GFP可作为一种有价值的荧光探针来标记PIP2的动态变化;渥曼青霉素、LiCl、U73122和新霉素四种阻断剂对ATP刺激内源性GPCR受体引起的PIP<,2>代谢过程有不同的影响;胰岛素刺激内源性RTK受体引起的PIP<,2>水解作用弱于ATP刺激内源性GPCR受体引起相应作用,PIP<,2>生成PIP<,3>的过程可通过GRP1PH-GFP的荧光由胞浆到胞膜的转位变化来观察.二、PLC<,δ1>PH-GFP与PIP<,2>结合可预防新霉素对磷脂酶C水解膜磷脂PtdIns(4,5)P<,2>的抑制作用.结论:尽管磷脂酶C<,δ1>的PH区与新霉素都可通过相似的作用结合PIP<,2>,但它们二者却对受体介导的PLC的激活以及PIP<,2>的水解有不同的作用.三、花生四烯酸对M<,1>受体介导的Kir2.1、Kir2.3,Kir2.3(I213L)电流的调节.结论:AA可选择性增强Kir2.3电流,而对Kir2.1电流无影响.AA对Kir2.3的特异性调节作用可能与PIP<,2>有关,因为AA对Kir2.3的突变体Kir2.3(I213L)(可增强Kir2.3与PIP2的相互作用)的调节作用明显降低,AA对Kir2.1(与PIP<,2>的相互作用明显强于Kir2.3)无影响.四、胆固醇对内向整流钾通道kir2.1和kir2.3的不同调节作用.结论:随着细胞膜上胆固醇水平的降低,可以明显增强Kir2.1通道的电流密度,而Kir2.3通道对此处理因素不敏感;细胞膜上胆固醇水平的降低可明显升高膜磷脂PIP<,2>的流动性,并降低膜磷脂PIP<,2>的含量,提示胆固醇对Kir2.1的特异性调节作用可能与PIP<,2>有关.
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