论文部分内容阅读
很多古菌生活在极端环境条件下,其基因组DNA更容易受到损伤。DNA双链断裂(DSBs)是一种比较严重的损伤方式,可导致生物体死亡。同源重组修复是生物体修复DNADSBs的一种精确的途径。在细菌中,同源重组修复主要包含RecBCD、RecFOR和SbcC-SbcD路径。在真核生物中,同源重组修复主要由Mre11-Rad50及Nbs1(哺乳动物细胞)或Xrs2(酿酒酵母)介导,其具体的修复机制不十分清楚。古菌作为生物界的第三种生命形式,有着与细菌相似的基因组织方式(存在operon形式),在DNA修复蛋白及机制方面却更类似于真核生物。生活在极端环境下的古菌的基因组突变频率与真核和细菌相当,说明这些古菌具有高效的DNA修复能力。因此,研究古菌高效的DNA修复机制有助于揭示真核生物的DNA修复分子机制,从而为人类的多种疾病预防起到指导作用。古菌中含有真核生物中参与同源重组修复的Mre11和Rad50的同源蛋白,却未发现Nbs1或Xrs2的同源蛋白。古菌中也存在MR复合物(Mre11-Rad50)介导的同源重组途径,但其机制又与真核细胞不完全相同。其中Mre11具有3’-5’ssDNA核酸外切酶和核酸内切酶活性,Rad50是ABC(ATP-bindingcassette)型ATPase,MR复合物可切割双链DNA形成3’-overhang结构。在嗜热古菌的基因组中,与编码Mre11和Rad50基因处于同一个操纵子之内的还有核酸酶NurA和解旋酶HerA编码基因。前期对Sulfolobus tokodaii中蛋白的生化性质研究显示,NurA具有5’-3’ ssDNA和dsDNA核酸外切酶活性及单链环状DNA内切酶活性,同时还发现StoNurA蛋白和StoSSB蛋白具有物理和功能上的相互作用。而StoHerA蛋白对多种DNA底物都具有解旋活性。对炽热球菌Pyrococcusfuriosus的体外研究显示,NurA和HerA蛋白有直接相互作用,并与MR复合物共同参与DNA双链断裂的同源重组修复过程。但是现有的生化性质研究并没有揭示出它们相互作用的方式和共同处理断裂DNA末端的机制。我们尝试通过Red/ET重组技术直接克隆模式古菌冰岛硫化叶菌S.islandicus Rey15A中MRHN的大片段基因簇并表达、纯化蛋白和蛋白复合体,初步研究其蛋白质复合体形成的规律。在这四个蛋白中,Mre11和Rad50的晶体结构分别于2001年和2000年被Hopfner课题组报道,晶体结构及体外生化性质实验表明Mre11和Rad50能形成稳定的异源四聚体(Mre11)2(Rad50)2,可以加工双链断裂DNA的末端形成3’-overhang结构。NurA的晶体结构于2012年被解析并报道出来[1],显示NurA以二聚体形式存在,且有一个与HerA相互作用的疏水界面。本课题也尝试解析冰岛硫化叶菌S.islan icus中HerA的晶体结构。首先在冰岛硫化叶菌中过表达SisHerA,得到足够的蛋白用于晶体初筛,并对得到的晶体进一步优化,最终在4%TacsimatepH7.4,13.5%PEG3350条件下得到了蛋白晶体,但该蛋白晶体分辨率为17 A,未能到达结构解析的要求。之后我们又尝试在大肠杆菌中过表达SisHerA及其突变体蛋白,但最终得到的晶体都不具有较高的分辨率以用于结构解析。另外,本实验室前期曾通过体外pull-down实验发现StoHerA和StoMre11在物理和功能上都具有相互作用,本研究尝试进一步证实这一现象。我们在大肠杆菌中表达了野生型StoHerA及其突变体,以及Mre11截短突变体蛋白,但未能得到野生型的Mre11蛋白。