系统性红斑狼疮(SLE)是严重危害人类健康的自身免疫性疾病。肾脏是该病最常受累的器官(称为狼疮性肾炎,LN)和主要死亡原因。目前该病的发病机制尚未明了,从中医理论出发,结合现代医学探讨 LN 的发病机制及治疗方法已成为该病研究的一个重要方向。本课题参照 Bergjk 报道的方法成功诱导了慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼疮样小鼠模型,在此基础上,观察临床上证实有较好疗效的中药方剂补肾清热毒方对 cGVHD 模型的作用,并进一步从细胞凋亡及 Th 亚群功能失衡方面探讨 LN 的发病机制和补肾清热毒方发挥作用的分子机制。本课题分四部分进行:1. cGVHD 狼疮样小鼠模型的诱导选用 6-8 周龄的(DBA/2×C57BL/6J)F1 小鼠,通过尾静脉注射雌性 DBA/2 小鼠的淋巴细胞制作模型。取雌性 DBA/2 小鼠的脾、胸腺、淋巴结制成淋巴细胞混悬液,注射时间是 0、3、7、10 天,每次注射 50×106个活细胞。于注射后 0、2、4、8、10、12 周检测尿蛋白浓度并处死部分小鼠,分别取血及肾脏标本,测定抗 dsDNA 自身抗体、血肌酐、尿素氮、血脂和观察肾脏病理改变。尿蛋白浓度用考马斯亮蓝法,自身抗体用间接免疫荧光法,肾组织制成石蜡切片后,经 PAS、Masson、PAM 染色光镜下观察病理改变,同时用透射电镜观察肾组织超微结构变化。结果 F1 小鼠注射母鼠淋巴细胞后 2 周产生抗 dsDNA 自身抗体,出现蛋白尿,4 周血脂、血肌酐、尿素氮轻度升高(P<0.05),肾脏病理仅有系膜细胞轻度增生,未见间质损害。8 周血肌酐等血生化指标明显改变,肾脏病理示肾小球系膜细胞中度增生,间质炎细胞浸润和肾小管大量蛋白管型,10-12 周尿蛋白浓度、抗 dsDNA 自身抗体、血肌酐、尿素氮、胆固醇、甘油三脂明显升高(P<0.05 或 P<0.01),白蛋白明显降低(P<0.01),病理出现局灶或弥漫肾小球硬化,免疫荧光示 IgG、IgM、C3 沿毛细血管壁及系膜区沉积。模型组电镜下可见系膜区免疫复合物沉积。实验结果表明 cGVHD 狼疮样小鼠模型类似人类狼疮性肾炎,是良好的狼疮性肾炎模型。2.补肾清热毒方对 cGVHD 狼疮样小鼠模型的疗效观察模型雌鼠于诱导后第 4 周,随机分为补肾清热毒方组(10 只),强的松组(10 只),模型组(6 只)及未诱导的 F1 对照组(6 只),用药 8 周后处死,观察小鼠血清抗 dsDNA抗体、血肌酐、尿素氮、血脂及肾脏病理改变等指标。结果显示,经补肾清热毒方和强的松干预后,尿蛋白浓度、抗 dsDNA 抗体、血肌酐、尿素氮均有降低(P<0.05 或 P<0.01),白蛋白升高(P<0.05),而补肾清热毒方尚有降低胆固醇作用(P<0.05),两药对系膜细胞增生及间质炎细胞浸润有减轻作用(P<0.05),表明补肾清热毒方对 cGVHD 狼疮样小鼠模型具有良好的的治疗作用。3.补肾清热毒方对 cGVHD 狼疮样小鼠模型肾组织细胞凋亡的调节作用<WP=5>2 补肾清热毒方治疗狼疮性肾炎的疗效与机理的实验研究 按实验二方法进行分组并用药,采用原位末端标记法(TUNEL)染色观察肾组织细胞凋亡;免疫组化、western blot 和 RT-PCR 技术检测 Fas、FasL 基因转录及蛋白表达情况。结果表明补肾清热毒方可增加肾组织 TUNEL 阳性积分,上调 Fas、FasLmRNA 和蛋白水平,提示补肾清热毒方治疗 LN 的作用可能是通过上调 Fas、FasL,促进细胞凋亡实现的。 4.补肾清热毒方对 cGVHD 狼疮样小鼠模型 Th1/Th2 细胞因子的影响 按实验二方法进行分组并用药,采用放射免疫法检测外周血 IL-2、TNF-α、IL-6 水平,结果补肾清热毒方对促进Th1细胞分化,从而加重免疫反应的IL-2,及前炎症因子IL-6、TNF-α 均有抑制作用,表明补肾清热毒方对细胞因子引起的炎症反应有抑制作用。采用免疫组化和 RT-PCR 方法检测肾组织 IL-4、INF-γ 蛋白及 mRNA 的表达,以观察补肾清热毒方对肾组织 Th1/Th2 的影响,结果补肾清热毒方可下调肾组织 IL-4 水平,且 INF-γ / IL-4比值与正常对照组比值相近,表明补肾清热毒方具有调节 Th1/Th2 细胞因子平衡的作用。 以上研究结果表明,cGVHD 狼疮样小鼠模型肾组织细胞凋亡异常及 Th1/Th2 细胞因子失衡,在狼疮性肾炎的发病中起重要作用。补肾清热毒方通过影响肾组织细胞凋亡,调节凋亡调控基因 Fas、FasL 以及 Th1/Th2 细胞因子平衡两种机制而减轻肾脏病理损伤,这可能是该方取得疗效的分子机制之一。