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背景及目的:免疫功能紊乱是导致胆道闭锁（BA）肝脏损伤的重要发病机制,其具体机制未完全阐述。本研究初步探讨B细胞活化因子（BAFF）在胆道闭锁患儿中的表达及意义,并在RRV诱导胆道闭锁模型的小鼠中验证BAFF中和性抗体的作用。方法:1.收集2018年3月至2020年6月在我院肝胆外科通过胆道造影诊断为胆道闭锁的52例病例,作为BA组;诊断为胆总管囊肿的25例病例,作为CC组;并回顾性研究其临床资料。采用CBA（cytometric bead array）法测定BAFF在肝脏以及血浆中表达,以及血浆中的IFN-γ,IL-4,IL-17,IFN-β的表达。免疫荧光检测患儿肝脏组织标本中BAFF的表达以及BAFF与CD14,CD68共定位情况。用BAFF刺激分选的BA外周血CD19+B细胞并检测其培养上清Ig G4表达;分选CD19+B细胞与单核细胞共培养,检测共培养上清Ig G4表达水平;分选CD4+T和CD8+T细胞,用重组BAFF蛋白和BR3-FC刺激T细胞,检测IFN-γ的表达水平。2.新出生小鼠通过恒河猴轮状病毒（RRV）诱导建立胆道闭锁模型,将新出生的BALB/C小鼠随机分为三组:Control组:出生12-24h内腹腔肝下缘注射PBS;RRV组:出生12-24h内腹腔肝下缘注射RRV;RRV+anti-BAFF组:出生12-24h内腹腔肝下缘注射RRV,在第1天,第5天,第9天腹腔注射BAFF中和抗体（2mg/kg）。在12天取材分析表型,利用肝脏组织HE染色,评估肝脏汇管区的炎性细胞浸润情况。Masson评估不同组间小鼠的肝脏纤维化水平。实时定量PCR（RT-q PCR）检测不同组之间RRV病毒复制情况（NSP3,VP6）,通过13-plex检测评估肝脏组织,血清炎性细胞因子表达水平变化。利用流式细胞术检测各组小鼠肝脏组织以及脾脏组织中T细胞,B细胞,髓系细胞的各个亚群比例变化。同时分析T细胞IFN-γ,FOXP3,IL-17的表达,B细胞IL-6,IL-10等表达情况。利用ELISA检测小鼠血清中BAFF水平。结果:BA患儿血浆和肝脏组织中BAFF水平较胆总管囊肿（CC）对照组显著增多,（P<0.001,差异具有统计学意义）;并且肝脏组织中BAFF蛋白浓度与淋巴细胞浸润程度（根据淋巴细胞浸润程度分级）成正相关。在BA患者纤维化早期阶段,肝脏组织中BAFF蛋白浓度与纤维化程度成正相关。肝脏组织中BAFF蛋白浓度与淋巴细胞浸润程度评分+纤维化程度评分成正相关。BAFF能促进天然B细胞分泌Ig G4;CD19+B细胞与单核细胞体外共培养实验表明:阻断BAFF能显著降低B细胞Ig G4的表达,免疫荧光染色结果显示,免疫荧光发现BA患儿的肝脏中CD20+,Ig G4+表达较对照组CC显著增多。CD20+B细胞分泌的Ig G4主要沉积在门脉汇管区,提示Ig G4可能参与胆道闭锁疾病的进展。血清BAFF浓度与肝功能γ-GGT显著正相关（P<0.001,差异具有统计学意义）。BA患儿血清BAFF与血清IFN-γ显著正相关,而与IL-4,IL17无显著相关性。另外体外刺激实验表明,BAFF可直接刺激CD4+T细胞以及CD8+T细胞分泌IFN-γ。胆道闭锁模型小鼠中,1)Control组小鼠毛发旺盛,无发育迟缓,无黄疸,胆汁淤积等症状。RRV组小鼠均出现黄疸,毛发稀疏,体重减低等胆道闭锁症状,RRV+anti-BAFF治疗组中胆道闭锁发生率降低,表现为体重增长率增加,黄疸出现时间推迟,黄疸减轻。2)RRV组的肝脏外观黄染,表面颗粒状,伴坏死灶,胆囊显示不清,HE染色显示肝脏汇管区有大量的淋巴细胞浸润,大面积坏死灶,肝内胆管闭锁。Masson染色提示汇管区大量纤维化形成,RRV+anti-BAFF组肝脏外观无明显黄染及坏死灶,HE染色显示门脉汇管区的淋巴细胞浸润以及纤维化程度有所减少。3)RRV+anti-BAFF组血浆BAFF表达较RRV组和对照组显著降低。RRV+anti-BAFF组中脾脏B细胞（B220+）较RRV组显著降低,且B1-a（CD43+CD5+）,成熟B细胞(Ig DhiIg M+/-),滤泡B细胞(CD23hiCD21-),边缘区B细胞(CD23+/-CD21hi)显著降低。有趣的是,RRV组中IL-6+B效应细胞（占CD19细胞比例）较对照组明显增多,但RRV小鼠腹腔注射中和BAFF抗体后IL-6+B效应细胞的比例显著下调。同时RRV+anti-BAFF较RRV组相比较,IL-10表达明显上调,提示Breg（调节性B细胞）增多。4)RRV+anti-BAFF组小鼠的肝脏组织和脾脏组织中的CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌的IFN-γ较RRV组显著减少。RRV组中Treg（CD4+CD25+Foxp3+）细胞与对照组相比较显著降低,然而RRV+anti-BAFF组中的Treg细胞比例显著上调。5)阻断BAFF后肝脏组织中Kuppfer（F4/80+CD11b+）细胞比例以及吞噬E-coil（大肠杆菌）病原体能力与RRV小鼠相比显著改善。6)注射中和性BAFF抗体后炎症相关因子水平（TNF-α,MCP-1,IL-6,IL-12p70,IFN-β）较RRV组显著下调。结论:1.BA患儿中血清和肝脏BAFF表达较对照组显著上调,且肝脏的BAFF表达水平与肝脏炎症程度分级正相关性,在纤维化早期随着BAFF水平升高其纤维化程度增加,BAFF对BA疾病的诊断以及预后有重要参考价值。2.BAFF可能通过促进B细胞分泌大量Ig G4沉积在门脉汇管区介导BA。3.BAFF与IFN-γ水平呈正比,且体外实验证明BAFF能促进T细胞分泌IFN-γ,提示BAFF通过调节T细胞功能对肝脏造成损伤。4.在胆道闭锁小鼠模型中阻断BAFF抑制分泌IL-6的效应B细胞,促进分泌IL-10的调节B细胞,还可以显著降低T细胞分泌细胞毒性细胞因子IFN-γ,上调Treg细胞比例。此外,anti-BAFF改善肝脏Kuffer细胞比例以及病原体的吞噬功能。5.阻断BAFF在胆道闭锁模型中能显著改善黄疸,以及肝脏炎症纤维化水平。为胆道闭锁形成的机制以及潜在的治疗靶点提供了免疫学的实验基础。