流感病毒自其在19世纪末和20世纪初期首次有记载的大规模爆发而为人们所认识。不同血清型流感病毒的百年来的多次大流行和每个秋冬季节的反复出现和所招致的极大地经济和社会损失更使得对这种病毒的致病性和疫苗研究成为了全世界的热点。　　近20年来新近出现的高致病性禽流感(HighlyPathogenicAvianInfluenza，HPAI)H5N1病毒以其快速演化、基因多样性、宿主广泛、易在鸟类中传播、高于60％的确诊病例致死率以及潜在的人-人传播隐患引起了全世界的广泛关注。和传统季节性流感不同的多病毒株同时流行并且能够相互共同演化、在作为疫苗生产必需的鸡胚中的高致死率也给研发有效通用疫苗带来了困难和不确定性。　　尤其是随着HPAIH5N1病毒在东半球不同地区多种宿主的广泛传播和繁殖，不同病毒株间主要表面抗原血凝素蛋白的基因序列差异和由此导致的抗原性差异不断加大。至今根据其血凝素蛋白的遗传学性质可以被划分为十个亚枝和更多二级、甚或三级四级亚枝。世界卫生组织和各国不同研究组提出了各种不同的针对HPAIH5N1病毒的免疫原和免疫策略设计。　　在本论文中，我们采用的是另一种全新的思路和方法，即:基于全面综合的血清学分析来设计疫苗候选株。首先，我们构建了包含HPAIH5HA所有亚枝和二级亚枝HA蛋白的H5N1假病毒库、相应小鼠免疫血清以及多血清型流感病毒小鼠攻毒实验模型。然后，利用假病毒库、部分真病毒和小鼠血清对H5HA所有亚枝和二级亚枝HA蛋白的免疫原性和抗原性进行了综合分析。最后基于血清学分析设计了三价DNA疫苗(Tri-cladeDNA)，并通过多种体外、体内实验对此Tri-cladeDNA进行了有效性和广谱性评价。　　参照上述实验思路，本论文主要分为三个研究部分，并得到以下几点实验结论:　　第一部分为流感病毒假病毒库、野生型病毒和重组病毒系统的建立。我们在HPAIH5N1病毒的10个亚枝和各二级亚枝中分别分析得到其代表病毒株，利用分子克隆技术构建出上述17个代表株中血凝素蛋白的编码表达质粒。并使用此血凝素蛋白编码表达质粒库包装出了效价、血凝素蛋白量和单位体积病毒颗粒数三个指标俱全的相应假病毒库。另一方面，为了后续免疫原有效性和广谱性评价，本论文建立了包括H1N1、H5N1、H7N7和H9N2在内的多个不同血清型流感病毒的动物攻毒模型。其中在流感病毒H9N2野生型病毒株A/Swine/Jiangxi/1/2004的小鼠模型内驯化和H7N7重组病毒株A/Netherlands/219/2003的构建包装和小鼠模型内驯化实验中得到了一些初步的病毒毒力决定因素数据和分析。　　第二部分为HPAIH5N1亚枝HA蛋白的血清学分析。我们在构建出上述17个代表株中血凝素蛋白的编码表达质粒和相应假病毒库之余，还利用此17个代表株中血凝素蛋白的编码表达质粒免疫小鼠并获得了各株血凝素蛋白的相应小鼠免疫血清样品。使用各假病毒和小鼠免疫血清库，本论文进行了交叉中和实验及其数据整理、统计和分析。在将此假病毒交叉中和实验结果和传统的血凝抑制实验结果相比较，进而利用先进的生物信息学算法(AntigenicCartography)对交叉中和实验结果进行分析后，得出H5N1亚枝HA蛋白的血清学分析结果为:H5HA亚枝0、1、3、4、5、6、7.1和9聚集形成抗原集群1。亚枝2.1.3.2、2.2.1、2.3.4、2.4、2.5和8聚集形成抗原集群2，其中亚枝2.2.1和其它稍远。同时抗原集群1中的其它亚枝相比，pHK156(0)和抗原集群2的距离最近，预示着pHK156拥有同时和集群1以及集群2相似的抗原性质。而pHK5052(2.3.2.1)和pSX(7.2)和其余各亚枝H5HA均无明显交叉反应活性。　　第三部分为针对HPAIH5HA所有亚枝的通用免疫原设计和有效性分析。本论文在第二部分的血清学分析结果基础上，设计了针对HPAIH5HA所有亚枝的通用免疫原——Tri-cladeDNA。并对此Tri-cladeDNA在小鼠体内诱导出的T细胞反应和血清样品中的中和抗体反应、抗体针对不同假病毒的结合位点、疫苗的保护有效性和广谱性进行了评价。得到结果为:此Tri-cladeDNA疫苗能够诱导出针对所有现行高致病性H5N1病毒亚枝均有中和活性的广谱中和抗体，以及有效的T细胞免疫应答。然后在小鼠实验中证明此疫苗能够在高致命计量的异源H5N1病毒和多种不同血清型流感病毒感染下提供有效的保护，其中完全的被动免疫保护说明Tri-cladeDNA在体内诱导的血清介导的免疫反应占主要地位并能够提供较好的保护效果。