研究背景随着生物医学的发展,生物材料的应用越来越为广泛。生物材料不仅在提高人类的生活质量、保护人类健康、挽救生命等方面具有重大的社会效益,而且已经成为各国经济新的增长点。虽然现今已有很多种类的金属基生物材料广泛应用于临床,尤其在骨科（如脊柱矫形、断骨接合、颅骨修补等）,金属基材料已成为应用最广的承力植入材料,如不锈钢、钴合金、钛合金等等。但在这些金属材料当中,没有一种金属材料的性能能够完全满足人们的需要。因此,开发新型的金属基生物植入材料是有必要而且是十分迫切的。镁及镁合金由于资源丰富、价格低廉、密度低,比强度、比刚度高等优异的综合性能享有“21世纪绿色工程材料”之美誉,已被较为广泛地应用在航空航天、电子通信等领域。在骨科应用方面,镁及镁合金的比重与人体骨骼尤其是密质骨的比重最为接近,植入人体后不至于增加患者的负重和不适感,对其康复极为有利。镁及镁合金的杨氏弹性模量与人体骨骼的基本相当,有利于降低或消除植入物与人体骨骼界面的“应力屏蔽”,促进骨的生长和愈合。最近国内外学者研究发现镁有促进成骨作用,认为镁合金适合制作人工骨或骨内固定物。镁合金的这些独特的优势,引起了骨科和材料学专家的广泛关注。但镁合金的化学性质活泼,耐腐蚀性能差。如果植入机体,在骨折愈合之前其自身已降解,则起不到固定作用。因此国内外学者通过多种方法来改善镁合金的抗腐蚀性能。国内学者通过阶跃式阳极氧化表面改性技术有效地增加镁合金的耐腐蚀性及耐磨性,减缓了镁合金的降解,使其有望成为一种新型的生物医用材料。但通过此技术处理后的镁合金的生物相容性如何,尚不清楚。目的本研究采用动物实验,将镁合金植入动物体内观察局部炎症、骨诱导性;将镁合金浸提液注入动物体内观察急性全身毒性、皮内刺激反应、致敏反应。通过与现在临床上应用甚广、生物相容性良好的钛合金Ti-6Al-7Nb对照,初步研究阶跃式阳极氧化镁合金的体内生物相容性及骨诱导性。并通过实验来探索不同的制膜参数及材料类型对材料生物相容性的影响以及两者之间的内在联系及本质规律。由此为实现镁及镁合金的生物医用提供可行性证据。方法1.实验材料镁合金AZ91D（AZ₀）、ME20M（ME₀）及其在三种阶跃式阳极氧化条件下制备的材料（分别标记为AZ₁、AZ₂、AZ₃、ME₁、ME₂、ME₃）、高纯镁（H）、医用钛合金Ti-6Al-7Nb（Ti）,分别制成大小6mm×5mm×2mm块状、直径8mm,长20mm长柱状两种规格,清洗并消毒后备用。2.浸提液制备以上块状试样制备浸提液,浸提介质采用0.9%无菌生理盐水,试件表面积（cm²）与生理盐水体积（ml）之比为3:1,置于37℃培养箱内72h使金属离子尽可能多的析出,0.22μm微孔滤膜过滤除菌,制备出材料浸提液。3.实验动物新西兰大白兔24只、昆明小白鼠88只、豚鼠80只,由南方医科大学附属南方医院动物实验中心提供,开放系统动物饲养环境。4.植入实验在新西兰大白兔脊柱两侧各选择3个植入点,将上述圆柱形材料植入肌肉内。每只兔植入Ti、H各1个,镁合金AZ（AZ₀—AZ₃）4个或者镁合金ME（ME₀—ME₃）4个。术后定期抽血测镁离子浓度,摄X线片了解材料大体降解情况。1个月、3个月和6个月各处死试验动物8只,观察伤口愈合情况,取出材料及周围肌肉组织,显微镜下观测材料周围纤维包膜厚度及组织炎症反应。5.急性全身毒性实验小鼠随机分成试验组（镁合金）、阴性对照组（Ti）、阳性对照组（H）、空白对照组（生理盐水）,每组8只。各组分别经尾静脉注射相应材料浸提液及生理盐水。注射后即刻、4、24、48及72h观察小鼠一般状态及毒性表现和死亡数,注射后24、48、72h监测体重变化。显微镜下观察肝脏炎性反应。6.皮内刺激实验在豚鼠脊柱两侧剃毛区各选择2个点,每两点至少间隔2cm。四点随机注射0.1ml试验组、阳性对照组（H）、阴性对照组（Ti）浸提液以及生理盐水（空白对照组）。注射后24、48及72h检查注射部位,观察注射局部及其周围皮肤组织的反应。镜下观察炎症细胞种类及反应分级。7.致敏实验将上述浸提液、生理盐水和体积分数为5%的甲醛溶液分别与完全弗氏佐剂等容积混合至乳化。采用皮内注射和涂皮相结合的诱导法。将48只豚鼠随机分为试验组36只（AZ组、ME组、H组均4只）、空白对照组（生理盐水）4只、阴性对照组（Ti）4只和阳性对照组（甲醛）4只。剃毛后在每只豚鼠背脊柱两侧6点对称皮内注射。皮内注射1周后,贴敷于标准材料浸提液、阴性和阳性对照液中浸泡至饱和的2cm×4cm滤纸片进行第2次致敏,固定并留置48h。14d后,将豚鼠腹部一侧剃毛,贴敷同前滤纸片并固定24h进行激发。除去贴敷物24h后观察腹部激发部位皮肤反应或疹块发生,镜下观察炎症细胞种类及反应分级。8.统计学分析采用SPSS13.0软件,对手术前后镁离子浓度比较采用配对t检验;各组之间镁离子浓度升高值比较用析因分析;植入试样周围组织炎症反应分级用秩和检验;试样周围纤维包膜厚度用析因方差分析;小鼠试验前后体重采用配对t检验;各组之间用单因素方差分析;P＜0.05时有统计学意义。结果1.植入实验一般情况:植入试样后一般情况良好。血镁离子浓度:逐渐升高,各时间点有显著差异,AZ组和ME组之间无显著性差异（P＞0.05）,AZ、ME组1个月、3个月、6个月时镁离子浓度术后升高值之间均有阳性差异（P=0.000）。X线片:各试样大体完好,各时间点各镁合金试样周围均存在密度减低区（气泡）。肉眼观察:各时间点各镁合金试样周围均存在包膜和气泡,植入点未见红肿,无异常分泌物。组织学观察:炎症反应AZ₁、AZ₃、H、Ti组均为Ⅰ级,其他镁合金组稍差。包膜反应AZ₃、Ti组均为Ⅱ级,AZ₁组6个月时差,其他各组反应重,包膜厚度AZ₁＜AZ₃＜Ti＜其他镁合金。成骨作用:AZ₃、ME₀组个别试样周围出现软骨组织,成骨细胞活跃。2.急性全身毒性实验一般情况:各组实验后一般情况均可。AZ₁、AZ₃组小鼠注射镁合金浸提液后体重变化不明显,无统计学差异（P＞0.05）,其他组小鼠注射镁合金浸提液后体重降低稍明显。组织学观察:Ti、AZ₁、AZ₃组肝脏组织形态无明显变化,无明显充血水肿或坏死。H组肝脏组织形态正常,轻度充血水肿,无明显炎症反应。其他组肝脏发生轻至中等程度形态改变和肝细胞变性。3.皮内刺激实验肉眼观察:生理盐水、Ti、AZ₁、AZ₃注射部位皮肤肉眼观察无红斑,未见水肿,皮内刺激反应评分0分;其余试样注射部位皮肤存在零星的轻度红斑、轻微水肿,皮内刺激反应评分1分。组织学观察:生理盐水、Ti、AZ₁、AZ₃注射部位皮肤未见炎症细胞,组织未见充血、水肿、坏死,炎症细胞反应Ⅰ级。其余试样注射部位存在少量淋巴细胞,组织轻度充血水肿,无坏死,炎症细胞反应Ⅱ级。4.致敏实验肉眼观察:甲醛组腹部激发部位皮肤明显坏死结痂,致敏反应严重,分级为4级。生理盐水组腹部激发部位无红斑及水肿,致敏分级为0级。Ti、AZ₁、AZ₃腹部激发部位红斑、水肿极轻微（1级）。余试样腹部激发部位皮肤有局限性红斑及轻度水肿,致敏反应2级。组织学观察:甲醛组细胞坏死,淋巴细胞较明显聚集在坏死区及周边部位,炎症反应为Ⅳ级。生理盐水组无炎症细胞聚集,无充血水肿,炎症分级为Ⅰ级。Ti、AZ₁、AZ₃有少量淋巴细胞聚集,未见明显充血水肿（Ⅱ级）,余实验组组织内存在中等量炎性细胞,充血水肿稍明显,炎症反应分级Ⅲ级。结论植入实验中AZ₁、AZ₃、H试样在局部炎症反应中表现良好,AZ₃试样包膜反应较好。急性全身毒性实验、皮内刺激实验和致敏实验中AZ₁、AZ₃表现较好。综上所述,AZ₃综合体内生物相容性最佳,AZ₁尚可。