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尿石症是泌尿科常见疾病,病因非常复杂。它与自然环境、社会条件、全身新陈代谓十紊乱及泌尿系统本身的疾患有关。目前按结石的成分可分为草酸钙结石、磷酸钙结石、磷酸镁铵结石、尿酸结石和胱氨酸结石。其中胱氨酸结石占所有肾结石的1%~3%,由尿中胱氨酸过饱和所致。胱氨酸结石具有不易溶解、质地较硬,且容易复发的特点,一旦结石形成多需手术治疗,创伤较大。准确地定量尿液中的胱氨酸可以及时采取必要的预防措施,有效地阻止胱氨酸结石的形成。
本文在以下三个方面进行了研究:(1)胱氨酸可由两个半胱氨酸氧化生成,在测定胱氨酸时,如果不加入巯基保护剂,半胱氨酸极易自氧化为胱氨酸对胱氨酸测定造成干扰。本实验用丙烯腈作为巯基保护剂,建立了准确测定胱氨酸的方法,有效去除半胱氨酸对胱氨酸分离定量的影响,比较了丙烯腈和文献报道的碘乙酸作为巯基保护剂的转化效率,结果显示用丙烯腈作为巯基保护剂的方法更简便、省时;(2)生物样本(尿)中胱氨酸含量的测定,考察了胱氨酸量与疾病的关联;(3)对尿生物样本中胱氨酸的提取方法进行研究;首次尝试用纳米纤维提取胱氨酸。论文主要工作如下:
一、建立柱前衍生化-高效液相色谱法测定胱氨酸的方法及其评价
胱氨酸本身不含有芳香环等生色团,无法直接检测,因此选用柱前衍生试剂-丹酰氯,先将胱氨酸衍生为具有较强紫外和荧光吸收的衍生物,通过测定胱氨酸衍生产物的紫外吸收对胱氨酸进行定量分析。但尿液中的半胱氨酸在衍生化过程中极易自氧化为胱氨酸,对胱氨酸准确定量造成干扰。
本文建立了准确测定尿液中胱氨酸的高效液相色谱法。采用丙烯腈作为巯基保护剂保护半胱氨酸巯基,消除半胱氨酸对胱氨酸定量测定的干扰。色谱柱为KromasilC<,18>(4.6×250mm,5um),丹酰氯为柱前衍生试剂,流速为1ml/min,紫外检测器检测。胱氨酸在1mg/L~500mg/L范围内,线性关系良好(r=0.9992),本方法简便、快速、准确,可用于尿液中胱氨酸的测定。
二、尿液中胱氨酸含量与年龄、疾病严重程度相关性初步研究
用建立的方法测定了正常人和胱氨酸结石患者尿液中的胱氨酸含量,正常人测定结果在7.84~10.1μg/mL(9 mg/d~13 mg/d,3710~4776μmol/M肌酐),与文献报道的小于20mg/d相符合。测定了四例胱氨酸结石患者的尿胱氨酸含量,24小时胱氨酸总量分别为72.98mg,801.5mg,874.6和1093.2mg。胱氨酸浓度显示了与年龄、疾病严重程度的相关性。
三、生物样本中目标物前处理方法的研究
以聚苯乙烯(PS 10%)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA 4%)、PS-NH<,2>、PMMA-NH<,2>、PS-Cu、PS-COOH电纺纳米纤维为萃取介质,填装固相微萃取小柱,提取尿液中的胱氨酸,提取回收效率最高可达54%,实验采用流动注射、邻苯二甲醛衍生、HPLC-Flu法摸索条件,确立最佳条件后,用丹酰氯衍生、HPLC-UV法分离测定胱氨酸。
以上各种纳米纤维填充小柱对胱氨酸的提取效率还不十分理想,推测因为胱氨酸为极性分子,其与水的亲和性大于与固相介质的亲和性,为了进一步了解纳米纤维填充小柱提取作用机理,本文选取一种弱极性的药物维拉帕米作为模型分子,以电纺纳米纤维为萃取介质,填装固相微萃取小柱,从生物样本中提取该药物分子,从水中提取维拉帕米的提取回收率可达100%左右,血浆中提取回收率可达88.1%,该结果验证了本文对纳米纤维固相萃取机理的假设与猜想,要提高目标物的萃取效率,必须以相似相溶原理为基础,在纳米纤维上修饰对目标分子亲和的官能团,增加目标物在固-液两相间的分配系数,从而提高固相萃取效率。