Hedgehog信号通路在脊椎动物组织形态发生以及细胞定向分化的过程中有着重要的调控作用,与胚胎发育、器官再生和肿瘤的发生关系密切。在早期发育期,由基因突变所导致的Hedgehog信号通路受阻或者异常活化会导致各种先天性的发育畸形。而Hedgehog信号通路的异常激活则会导致许多肿瘤的产生。虽然许多小分子药物在治疗基底细胞癌和髓母细胞瘤上已经取得了明显的效果,而在2012年1月30日,美国食品药品监督管理局也批准了Erivedge (vismodegib胶囊)作为治疗扩散后、复发且不宜放疗的基底细胞癌的第一个药物。但这些药物都针对Smo这一单一靶点,当Smo基因发生突变时,这些药物都会产生抗药性。因此,Hedgehog信号通路的研究不仅是目前细胞分子生物学和发育遗传学领域的重要课题之一,而且对Hedgehog信号通路特异性的肿瘤的临床治疗具有重要意义。Hedgehog信号通路的转导从果蝇到脊椎动物进化上是高度保守的。在脊椎动物中,Hedgehog配基不存在的情况下,十二次跨膜蛋白受体Ptch1会抑制七次跨膜蛋白受体Smo的活性,gIi基因编码的Gli2、Gli3蛋白经蛋白酶体加工成其抑制子的形式,从而抑制了Hedgehog信号通路的活性。当Hedgehog配基存在的情况下,Hedgehog配基与Ptch1结合,从而解除了Ptch1对Smo的抑制,Smo将信号传递到下游的Gli蛋白,Gli蛋白经蛋白酶体加工的过程被阻断,从而以其全长激活子的形式激活Hedgehog信号通路下游靶基因的表达。另外,在脊椎动物中,Hedgehog信号通路的正常转导还依赖于原纤毛这个细胞器。而原纤毛的生成和维持又依赖于intraflagellar transport (IFT)运输。IFT运输分为从原纤毛的基底部向原纤毛的顶部进行的顺行性运输以及从原纤毛的顶部向原纤毛的基底部进行的逆行性运输。参与顺行性纤毛内运输的蛋白有马达蛋白Kinesin-2及IFT B复合物,参与逆行性纤毛内运输的蛋白有马达蛋白Dynein及IFT A复合物。Kinesin-2、Dynein及IFT蛋白的正常表达对脊椎动物内原纤毛结构的生成和维持以及Hedgehog信号通路的正常转导是必要的。但IFT运输是如何调控Hedgehog信号通路的转导的?在此调控过程中又是否涉及到一些未知的蛋白?目前对这方面的研究还不清楚。我们利用IFT B复合物中的组成成员IFT88的抗体,进行免疫沉淀实验,再对其结果进行质谱分析,发现IFT88蛋白可以与DGKδ、IFT81、Klra19结合。IFT81作为IFT B复合物中的组成成员之一,验证了此实验系统的可行性。其中,DGKδ引起了我们极大的兴趣。为了验证IFT88与DGKδ之间的结合是特异性的,我们在293T细胞中外源性过表达IFT88蛋白和DGKδ蛋白,再通过蛋白质免疫共沉淀实验验证了两者结合的特异性。同时我们还发现,IFT88还可以与DGK家族的另外六个成员DGKα、DGKβ、 DGKγ、 DGKε、 DGKζ、DGKι结合。DGK家族的这七个成员蛋白结构中所共有的结构是C1结构域及催化结构域,所以我们猜测IFT88与DGK蛋白之间的结合与这两个结构域中的其中一个相关,或者与这两个结构域都有关系,但还需要进一步地验证这一猜想。那么,与IFT88特异性结合的DGKδ是否调控Hedgehog信号通路的转导呢?为了回答这个问题,首先我们设计了可以特异性敲低DGKδ的siRNA。用siDGKδ敲低Hedgehog信号通路被激活的细胞中的DGKδ后,Hedgehog信号通路的靶基因gli的产物Gli1的mRNA水平和蛋白水平都有明显的降低。说明DGKδ对Hedgehog信号通路的转导具有正向的调控作用。为了进一步验证这一结论,我们采用了DGK的两种广谱抑制剂：R59022和R59949。我们对分别被ShhN配基和Smo的激动剂PURM激活通路活性的细胞进行两种抑制剂的工作浓度梯度增加的处理,再检测处理后荧光素酶报告基因的活性及Gli1蛋白水平的变化。我们发现,当用ShhN配基激活细胞Hedgehog信号通路时,DGK的两种广谱抑制剂都可以不同程度的特异性抑制Hedgehog信号通路的活性,其中R59949的抑制性相比更强。而当我们用PURM激活细胞Hedgehog信号通路时,DGK的两种广谱抑制剂并不能特异性的抑制Hedgehog信号通路的活性。这个有趣的结果提示我们DGKδ对Hedgehog信号通路的调控位点位于Smo的上游。为了进一步验证DGK抑制剂对Hedgehog信号通路的抑制作用是特异性的而不是由于药物毒性所导致的,我们降低了药物的处理时间,并通过免疫荧光实验观察Gli3蛋白在原纤毛结构中的定位情况的变化。我们发现,两种DGK抑制剂都会抑制Gli3蛋白在原纤毛中的定位。综上,我们可以得出结论：DGKδ对Hedgehog信号通路具有正向调控的作用。本研究工作旨在探索通过IFT运输调控Hedgehog信号通路活性的蛋白及其调控机制。研究中发现IFT B复合体中的IFT88蛋白可以特异性地结合DGKδ蛋白,而且DGKδ蛋白对Hedgehog信号通路的转导具有正向调控的作用。本研究工作将脂质代谢与Hedgehog信号通路的转导联系在一起,对更好地理解Hedgehog信号转导的调控机制和Hedgehog信号通路特异性的肿瘤的临床治疗都有重要的意义。