背景神经与血管共同参与骨的生成、发育与功能行使,组织工程骨在体内存活并发挥正常分泌、代谢与促进造血等功能,方为成熟的骨组织。目前神经与骨之间的关系研究较少,且多局限于单因素研究,然而组织工程骨在体内的构建则是多种种子细胞共同作用的结果。神经对骨的作用,部分是通过对血管的作用而间接影响到成骨的。神经与血管之间的作用较为复杂,且当前研究的结果也不一致。本研究通过研究神经构建的种子细胞与血管构建的种子细胞之间的某些相互作用,寻找在组织工程骨构建过程中来自宿主自身的促血管化因素,在优化成骨效能的同时,以期为后期同步构建血管与神经化组织工程骨奠定实验基础。目的1.研究SCs对不同来源的血管内皮细胞增殖、迁移、分泌与形成血管的影响。2.研究SCs促进BMSCs来源的血管内皮细胞形成血管功能的机制。3.体内外研究SCs与BMSCs来源的血管内皮细胞共同作用下局部的成骨效应。材料与方法1.大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、主动脉血管内皮细胞(AECs)与雪旺细胞(SCs)的分离、培养与鉴定及BMSCs向内皮细胞的诱导分化以全骨髓法分离培养大鼠BMSCs,进行流式细胞表面抗原检测、诱导成骨、成软骨、成脂分化进行鉴定；以血管内膜消化法分离培养大鼠AECs,以含有血管内皮细胞生长因子(VEGF)与肝素钠的M199培养液进行纯化,以血管假性血友病因子(Vwf)与血小板源内皮细胞黏附因子1 (Pecam-1)的细胞免疫荧光(IF)鉴定；以组织块贴壁法分离培养大鼠SCs,以含有阿糖胞苷(Ara-C)、法斯科林(Forskolin)与胶质细胞生长因子(HRG1-β)的低糖DMEM培养液进行纯化,以抗S-100进行细胞免疫组化(IHC)鉴定。采用低浓度胎牛血清(FBS)、含有VEGF、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-B(、胰岛素样生长因子R3-1(R3-IGF-1)的内皮细胞生长培养基2(EGM-2)将BMSCs诱导分化血管内皮细胞(IECs),通过Vwf与Pecam-1的IF、透射电镜(TEM)观察、实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测Vwf、 CD34、 VEGF受体2(Kdr)、诱导型一氧化氮合酶(Nos2)、结构型一氧化氮合酶(Nos3)基因表达的方法进行鉴定,并与AECs和BMSCs进行表达量的比较。表达量相对值采用One-Way ANOVA进行分析,方差不齐采用Welch校正。将BMSCs作为对照组,两实验组的数据与对照组比较采用置信区间法。2.SCs对血管内皮细胞增殖、迁移、分泌、体内外成管功能的影响及其初步的机制研究收集SCs条件培养基(SC-CM),培养IECs与AECs作为实验组,以不含生长因子的普通培养液培养IECs与AECs作为对照组,于Id、3d、 5d、7d、 9d, 11d以CyQuant法进行细胞数量的检测,以酶联免疫吸附剂测定(Elisa)法检测SC-CM中VEGF的浓度。采用Transwell共培养的方法,下层种植SCs作为实验组,不种植细胞作为对照组,上层种植IECs或AECs,于16h后观察迁移至下层的细胞,以结晶紫染色并以乙酸洗脱,测定洗脱液的吸光光度值(OD),于1 d、 3 d、7d、 10 d以qRT-PCR的方法检测两组IECs与AECs的Pecam-1与CD34基因mRNA表达变化。采用Transwell共培养的方法进行SCs与IECs或AECs的非接触式共培养作为实验组,IECs或AECs单独培养作为对照组,于1d、3 d、5 d、7 d收集培养液并检测其中一氧化氮(NO)的浓度,于1 d、 3 d、 7 d、10 d以qRT-PCR的方法检测两组IECs与AECs的Nos2与Nos3基因mRNA的表达变化。采用SC-CM培养IECs或AECs作为实验组,以不含生长因子的普通培养液培养IECs与AECs作为对照组,6h后观察细胞在基质胶内的成管情况。采用明胶作为载体,将SCs与IECs以SC-CM混合作为实验组,将IECs以内皮细胞诱导液混匀作为对照组,将明胶-细胞悬液注射入大鼠角膜基底层,12 d后自主动脉进行墨汁灌注,观察角膜内部注射点的血管生成情况。增殖实验中测得各时间点的细胞数量值及靶基因mRNA表达量相对值的整体比较采用析因设计资料的方差分析进行处理,同一组别不同时间点或同一时间点不同组别的比较均采用One-Way ANOVA进行处理,用LSD法对各组数据进行多重比较。迁移实验中脱洗液的OD值采用One-Way ANOVA进行处理。如经Levene检验,数据不满足方差齐性,则采用方差分析的近似方法Welch法进行统计分析,多重比较采用Games-Howell法。3.SCs对IECs成血管作用的机制及对BMSCs成骨分化的影响采用SC-CM刺激培养IECs或ECs作为实验组,以不含生长因子的普通培养液培养IECs与AECs作为对照组,于1d、3d、7d、10d收集培养液并以Elisa法检测其中VEGF的浓度变化。以IF法检测IECs与AECs的巢蛋白(Nestin)表达；以Transwell共培养的方法进行SCs与IECs非接触式共培养作为实验组,IECs或AECs单独培养作为对照组,于1d、3d、7d、10d以qRT-PCR的方法检测IECs的Nestin基因nRNA表达量变化；用SC-CM刺激培养IECs作为实验组,以不含生长因子的普通培养液培养IECs作为对照组,于10d以IF双标法检测IECs的巢蛋白与VEGF受体1(VEGFR1)的共同表达。以Transwell共培养的方法进行SCs与IECs非接触式共培养作为实验组,SCs单独培养作为对照组,于1 d、3d、7d、10 d以qRT-PCR的方法检测两组SCs的基质金属蛋白酶14(Mmp14)与金属蛋白酶组织抑制剂(Timp2)的mRNA表达量变化,于1d、3d、7d、10 d以免疫蛋白印迹(Western blot)法检测IECs与AECs的巢蛋白、VEGFR1、 VEGF受体2 (VEGFR2)的表达变化；收集以SC-CM刺激培养IECs或AECs的培养液,于1d、3d、7d、10d以Western blot法检测培养液中Timp2的表达变化。以SC-CM-DMEM-成骨诱导液共培养IECs与BMSCs作为实验组1,普通成骨诱导液共培养IECs与BMSCs作为实验组2,普通成骨诱导培养液培养BMSCs,分别于4d、7d、14d、21d检测各组BMSCs的碱性磷酸酶(ALP)、骨Y羧基谷氨酸蛋白(Bglap)、骨形态发生蛋白2(Bmp2)、Ⅰ型胶原a (Colla)、骨桥蛋白(Spp)的mRNA表达量变化。各组SCs表达Mmp14与Timp2的比较采用置信区间法。成骨相关基因的mRNA表达量相对值的整体比较采用析因设计资料的方差分析进行处理。同一组别不同时间点或同一时间点不同组别的比较均采用One-Way ANOVA进行处理,用LSD法对各组数据进行多重比较。如经Levene检验,数据不满足方差齐性,则采用方差分析的近似方法Welch法进行统计分析,多重比较采用Games-Howell法。4.预种植IECs与SCs的β-TCP支架材料体内构建血管化组织工程骨采用表达eGFP与RFP的病毒载体转染标记的BMSCs,在体外分别诱导分化为成骨细胞(IOB)与IECs,采用Hoechst 33342标记SCs,分别种植于P-TCP支架材料,扫描电镜与荧光显微镜观察细胞与支架材料的黏附。以负压抽吸法将SCs、 IECs预种植于β-TCP支架材料,3d后接种IOB作为实验组1；将IECs预种植于支架材料,3d后接种IOB作为作为实验组2；直接接种IOB作为对照组,将各组复合细胞的支架材料手术植入大鼠股骨中段6mm的骨缺损部位,于6w、12w进行X线、植入物组织切片的HE染色与Masson染色、MicroCT扫描,检测植入部位的成骨情况。结果1.分离培养的BMSCs镜下贴壁生长,呈梭型或双极型,细胞膜清晰,融合时平行或漩涡状排列,传代至第3代后细胞增殖速度变快,可向成骨、成软骨与成脂方向定向诱导分化,流式检测细胞表面抗原,细胞表达CD29、 CD44,不表达CD34、 CD45。分离培养并纯化的AECs镜下贴壁生长,呈多角形或卵圆形,细胞边界不清,融合时呈现“铺路石”样外观,Vwf与Pecam-1的IF检测呈阳性表达。分离培养并纯化的SCs镜下贴壁生长,胞体极窄,呈两极或单极,麦芒状外观,S-100的IHC检测呈阳性表达。BMSCs诱导分化成为的IECs镜下形态变得圆钝,与AECs相似,融合时呈现“铺路石”样外观,Vwf与Pecam-1的IF检测呈阳性表达,TEM检测可见细胞突触变多,细胞器与吞噬小泡增多,细胞核附近可见Weibel-Palade (W-P)小体,qRT-PCR检测AECs与IECs的Vwf、 CD34、Kdr、Nos2与Nos3基因的mRNA表达相对值均有显著性差异(P<0.05),IECs各指标均高于AECs。2. IECs在不同培养液中的细胞量有显著性差异(F=1556.000,P=0.000),各时间点实验组均大于对照组。AECs在不同培养液中的细胞量有显著性差异(F=134.900,P=0.000);各组在培养的各时间点中,第1天为最小值,此后实验组在第3天达到最大值,对照组在第5天达到最大值,之后均呈现下降趋势,且实验组小于对照组。实验组培养液中VEGF浓度分别为499.850 pg/mL与865.520 pg/mL。 IECs实验组迁移的细胞比对照组更多,洗脱液的OD值显著高于对照组(F=196.093,P=0.000)。两组IECs表达Pecam-1除第7天实验组高于对照组(F=293.746,P=0.000)外,其他均无显著性差异(P>0.05)。两组IECs表达CD34在各时间点均具有显著性差异(P<0.001),实验组均高于对照组。两组IECs释放NO具有显著性差异(F=184.219,P=0.000),实验组显著高于对照组。两组AECs释放NO总量具有显著性差异(F=14.170,P=0.002),但各时间点两组比较无显著性差异(P>0.05)。两组IECs表达Nos2具有显著性差异(P<0.001),实验组高于对照组；各组IECs在各时间点表达Nos2也具有显著性差异(P<0.001),其中,实验组在第7天时表达最高。IECs表达Nos3实验组在各时间点无显著性差异(F=6.673,P=0.062),对照组在各时间点有显著性差异(F=36.581,P=0.000)；两组相互比较除第10天(F=5.683,P=0.130)外,其余时间点两组比较均有显著性差异(P<0.05),实验组均高于对照组。IECs实验组较对照组体外成管数量更多、面积更大,而AECs两组相比则相似；体内成管实验组较对照组更为明显。3. IECs实验组与AECs实验组VEGF浓度均高于对照组,AECs实验组的VEGF总浓度值低于IECs实验组。IF显示,IECs表达巢蛋白为阳性,AECs为阴性。共培养实验中,IECs表达巢蛋白除第1天外,其他时间点实验组均高于对照组。各时间点IECs实验组在第1天时表达最低,之后呈上升趋势,直至第10天到达最高点；IECs对照组在第1天时表达最低,在第3天时表达最高,之后呈下降趋势。与IECs共培养的SCs的Mmp14 mRNA相对表达值在所有时间点均高于未共培养的SCs；各时间点表达量存在显著性差异(F=6.706,P=0.014),共培养10d时达到最高。与AECs共培养的SCs的Mmp14相对表达值在1d与3d时表达量高于未共培养的SCs,10d时则低于未共培养的SCs；7 d时与未共培养的SCs无差别；各时间点表达量存在显著性差异(F=338.739,P=0.000),共培养10d时达到最低。与IECs共培养的SCs的Timp2 mRNA相对表达值在所有时间点均低于未共培养的SCs；各时间点表达量存在显著性差异(F=25.324,P=0.005),共培养10d时达到最低。与AECs共培养的SCs的Timp2相对表达值在1d、3d与10d时表达量均高于未共培养的SCs；7d时与未共培养的SCs无差别；各时间点表达量存在显著性差异(F=117.827,P=0.000),共培养7d时达到最低。Western blot显示,IECs实验组表达巢蛋白与VEGFR1、 VEGFR2随时间具有逐渐增高的趋势,在3d之前实验组的3种蛋白表达均不明显,之后的表达显著强于对照组；AECs两组均不表达巢蛋白,实验组VEGFR1在各时间点均无表达,而对照组则有表达,两组VEGFR2的表达强度在各时间点相近。SC-CM-DMEM于各时间点的Timp2表达明显低于SC-CM-M199。实验组1、实验组2与对照组BMSCs的ALP、Bglap、Bmp2、Colla、Spp表达量均具有显著性差异(P<0.001),每个指标的表达量从低到高均依次为实验组1、实验组2、对照组。4. eGFP与RFP标记的BMSCs具有向成骨与血管内皮细胞方向诱导分化的能力,ALP、 Vwf与Pecam-1检测均为阳性。荧光显微镜与扫描电镜显示,3种细胞在β-TCP支架材料上均可较好地黏附。手术植入支架材料并以钢板与钢丝固定,术后动物状态良好。术后6w行植入物的组织切片HE染色,实验组1的材料中已有骨质长入,材料吸收处成骨细胞广泛分布肥大的软骨细胞与成骨细胞,材料的基本结构已不可见；实验组2与对照组的植入物中,仍可见材料的基本结构,未见有骨质长入,材料的微孔中长入较多的纤维组织,成骨细胞与软骨细胞罕见。术后12 w行植入物的组织切片Masson染色显示,实验组1材料已全部吸收或降解,骨质长入材料,临界部位可见肥大的软骨细胞广泛分布,新生骨质的胶原与材料内部广泛融合；实验组2有部分骨质胶原显现,但范围较为局限,新生骨质胶原染色较弱,成骨细胞与软骨细胞较少；对照组材料降解处可见纤维组织生长,但植入物中未见大面积的新生骨质胶原产生。MicroCT显示,12 w时各组植入的材料已大部分降解,实验组1在骨缺损处形成的骨质与正常骨质密度相近,排列致密,骨痂丰富,并桥接骨折断端；实验组2在骨缺损部位也有部分骨痂形成,但形成的骨质仅在缺损部位发生连接,并未桥接骨折断端,新生骨质稀疏、散在；对照组仅见微量的散在新生骨,骨缺损仍明显存在。结论1.SCs可促进IECs增殖；对AECs早期具有促进增殖的作用,但之后迅速转变为抑制作用。SCs对IECs具有直接趋化作用,可促进IECs释放NO,可能与SCs分泌VEGF,并上调Pecam-1、 CD34及促进一氧化氮合酶(NOS)活性有关。2.SCs可直接上调IECs巢蛋白的表达,进而促进VEGFR的表达。IECs可促进SCs表达Mmp14,而抑制其表达Timp2、从而加强SCs对IECs分化的促进效应。当SCs与IECs共同作用于BMSCs早期,BMSCs向成骨方向分化的进程滞后。3.在适宜的支架材料上预种植血管内皮细胞使其预血管化,可以提高支架材料在体内的成骨效率。SCs对IECs产生的促血管生成作用,可能在体内组织工程骨成骨的早期即能发挥效应。