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肝脏具有独特的诱导免疫耐受的功能,持续性表达或递呈于肝脏中的抗原物质通常会诱发针对该抗原的系统性免疫耐受而非免疫应答,诸如肝脏移植,慢性嗜肝病毒感染,口服耐受等。肝脏诱导耐受的特性与其生理结构,细胞组成等密切相关,例如肝脏的门静脉供血使其持续受刺激于肠道来源的共生菌及食物代谢产物；肝窦内血液储量丰富,血流极其缓慢；肝脏免疫细胞组成呈天然免疫优势状态且分布有多种致耐受的抗原递呈细胞。这些特征为肝脏诱导免疫耐受提供了时间与空间基础,从而通过诱导免疫抑制细胞、免疫偏离、T细胞无能以及克隆清除等各种机制实现系统性的抗原特异性免疫耐受。操纵肝脏的免疫耐受功能具有广阔的临床转化前景,例如肝脏移植可以使得后续的皮肤、肾脏等各器官移植排斥显著降低；肝脏过表达自身抗原可以有效抑制自身免疫病的发生；靶向肝脏的基因表达还可以避免免疫应答,从而极大改善基因治疗效果。而当嗜肝微生物,如乙肝、丙肝病毒感染时,病毒抗原持续表达于肝脏中同样会导致系统性免疫耐受,使得机体不能产生有效的抗病毒免疫应答,从而形成慢性感染,严重危害人类健康。由此可知,研究肝脏的免疫耐受机制,寻找免疫耐受维持与逆转的分子靶点,对于治疗包括自身免疫病,感染性疾病在内的一系列重大疾病具有十分重要的意义。本项研究旨在利用小鼠肝脏持续携带HBV所诱导的系统性耐受模型,研究肝脏诱导系统性免疫耐受的机制及逆转方法,具体工作分为两大部分：Ⅰ.基于白细胞介素12的疫苗疗法有效逆转HBV诱导的系统性免疫耐受1.HBV携带小鼠模拟肝脏病毒慢性感染诱导的系统性免疫耐受状态通过对小鼠尾静脉高压注射HBV质粒,可以成功实现HBV在小鼠肝细胞内复制表达,其中30%小鼠能长期携带表达HBV,且表现出无肝损伤,对外周HBV疫苗无应答的耐受状态,从而很好模拟了HBV慢性感染人群中的无症状携带者。2.基于白介素12的疫苗疗法能有效清除HBV病毒白介素12预处理以及同HBV疫苗共注射的治疗方式,我们称之为基于白介素12的疫苗疗法,可以有效清除HBV携带小鼠体内HBV病毒,导致HBsAg、 HBeAg、HBV DNA以及HBcAg显著降低,且不会造成肝损伤,是一种安全有效的潜在治疗方法。3.基于白介素12的疫苗疗法有效逆转HBV诱导的系统性免疫耐受白介素12联合疫苗治疗可以激起HBV携带小鼠体内HBV特异性记忆应答,诱发滤泡样T辅助细胞和生发中心B细胞扩增,anti-HBs抗体生成,T细胞特异性增殖等一系列HBV特异性应答,证实HBV诱导的系统性免疫耐受被逆转。4.基于白介素12的疫苗疗法协同有效刺激HBV特异性T细胞应答白介素12联合疫苗治疗主要通过适应性免疫系统,尤其是T细胞来发挥功能,可以显著增强抗原特异性CD4+T和CD8+T扩增,活化及效应功能发挥,并抑制调节性T细胞生成。结论Ⅰ：我们发现基于白介素12的疫苗疗法可以逆转HBV诱导系统性免疫耐受,激发强烈且多抗原反应性的anti-HBVT细胞应答,且抑制调节性T细胞生成,进而有效促进HBV携带小鼠清除HBV。Ⅱ.干扰素γ通过促进T细胞肝脏滞留而维持肝脏诱导的系统性免疫耐受1.干扰素γ(IFN-γ,)缺失导致系统性免疫耐受消失野生小鼠持续携带HBV时会导致形成系统性HBV免疫耐受,而在IFN-γ缺失(GKO)小鼠当中,尽管相较野生小鼠更容易持续携带HBV, HBV诱导的系统性耐受却不复存在,导致此小鼠在外周HBV疫苗免疫时发生显著应答,如HBsAg, HBeAg降低,anti-HBs出现,生发中心B细胞扩增,T细胞恢复特异性增殖等。2.CD4+T细胞来源IFN-γ维持系统性免疫耐受我们发现相较于对照小鼠,HBV携带小鼠肝脏CD4+T淋巴细胞在CD3和CD28抗体联合刺激时,产生IFN-γ水平显著增高。而通过转输重建实验,我们发现用IFN-γ缺陷的CD4+T细胞重建的CD4+小鼠诱导HBV耐受能力消失,同IFN-γ缺陷相类似。因而证明HBV携带过程中,主要由CD4+T细胞来源IFN-γ维持系统性免疫耐受。3. IFN-γ通过CXCL9介导的肝脏CD4+T滞留来维持耐受我们发现肝脏CXCL9水平在IFN-γ受体缺陷型HBV小鼠中表达显著低于野生HBV小鼠：与之相一致的是,IFN-γ受体缺陷型HBV小鼠肝脏滞留HBV-primed CD4+T细胞能力也显著低于野生HBV小鼠。而通过对IFN-y受体缺陷型HBV小鼠肝脏回复表达CXCL9可以恢复其滞留T细胞的能力,并部分恢复HBV诱导的系统性免疫耐受。进一步实验发现,在野生型HBV小鼠中预先阻断CXCL9的受体CXCR3可以部分逆转HBV诱导的系统性耐受。4.肝脏驻留巨噬细胞通过调控T细胞滞留参与耐受形成通过比较HBV与对照小鼠肝脏中不同细胞分泌CXCL9的水平,我们发现肝脏驻留巨噬细胞,即Kupffer细胞是HBV持续携带时肝内CXCL9的主要来源。利用脂质体清除Kupffer细胞可以显著降低肝内CXCL9水平,阻碍HBV-primed CD4+T细胞滞留,并打破HBV诱导的系统性耐受。而在Kupffer细胞清除的HBV小鼠肝脏中回复表达CXCL9,可以部分回复其耐受能力。结论Ⅱ:IFN-y对于肝脏维持系统性免疫耐受至关重要,其主要机制如下：HBV持续携带时,肝内CD4+T细胞通过IFN-y分泌,促进Kupffer细胞表达CXCL9,从而招募并滞留外周HBV特异性的CXCR3+CD4+T细胞,使其在肝脏中经历耐受。