背景:器官移植现在已经成为治疗终末期器官功能衰竭的有效手段,为缓解临床同种供体的不足,异种器官作为最可能的供体来源越来越受到重视。然而,异种器官移植作为远缘移植,其面临的排斥反应较同种移植更为强烈、复杂。异种器官移植排斥反应包括超急排(HAR)、延迟性排斥(DXR)、急性细胞性排斥(ACR)、移植物慢性失功(CGD)四个阶段。目前HAR被大量研究普遍认为已有方法(转基因猪、天然抗体抑制剂等)克服,接下来异种移植研究亟待克服的主要障碍是DXR,在这一过程中,由诱生抗体诱导的移植物Ⅱ型血管内皮细胞激活是异种移植物被排斥、功能丧失的关键。而核转录因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)对Ⅱ型血管内皮细胞激活起关键性作用。现已表明NF-κB的功能涉及到免疫反应、胸腺发育、胚胎发生、炎症和急性反应、细胞繁殖、细胞凋亡、病毒感染和其他多种病理过程。但尚未见有应用于研究心脏移植抗排斥方面。小鼠→大鼠心脏移植不发生HAR,而直接表现DXR,是研究DXR的理想动物模型。我们现拟利用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制小鼠心脏核因子κB(NF-κB)的表达,以期抑制异种移植延迟性排斥反应中Ⅱ型血管内皮细胞的激活,从而克服或减弱DXR,探讨RNA干扰技术在异种器官移植中的应用前景。方法:1.设计并化学合成针对小鼠NF-κB p65的siRNA,合成时对用于转染后示踪的部分siRNA进行荧光素FAM标记。2.小鼠血管内皮细胞(EOMA)的体外转染。分组:(1)空白对照组(细胞内不加任何干扰因素);(2)阴性对照组(细胞转染阴性对照siRNA,即siRNA-NC);(3)实验组(细胞转染NF-κB siRNA)。于转染前一天,接种EOMA细胞,在转染后的24h~72h时提取各组细胞总RNA,行RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA水平;提取各组细胞总蛋白,行Western blot测定NF-κB p65蛋白表达。3.将转染混合物(含2OD阴性对照siRNA)经颈静脉或尾静脉注入实验小鼠。48h后获取心、肺、肝、肾标本,快速冰冻切片荧光显微镜观察体内组织分布,对尾静脉途径与颈静脉途径对组织分布的影响进行比较。4.将转染复合物(含2OD siRNA-NC)经颈静脉注入小鼠,在从1小时到1周的五个时间点摘除心、肝、肺、肾四个器官切片行荧光显微镜检查。将2OD NF-κB p65siRNA和阳离子聚合物in vivo-jetPEI形成的复合物静脉注入成年小鼠,注射后第1、3、5、7天的五个时间点摘取心脏,提取总RNA,行Real-time PCR检查各时间点NF-κB p65mRNA水平动态变化。5.为分析剂量效应关系,实验分五组,每组3只小鼠,四组动物单次注射siRNA和in vivo-jetPEI复合物,siRNA量各组分别为1OD, 2OD, 3OD和4OD,in vivo-jetPEI量按N/P ratio=6和siRNA的量相应配置。其中一假手术组注射同等体积PBS溶液作对照。72h后获取小鼠心脏,行定量RT-PCR测定NF-κB p65 mRNA的表达。6.实验分四组,每组三只小鼠均被注射相同剂量的复合物(含2OD siRNA),实验动物的存活情况被连续观察一周。第1、3、5、7天抽血检测血清主要生化指标。7.分别将siRNA-NC和NF-κB p65 siRNA经in vivo-jetPEI乳化形成的复合物(含2ODsiRNA)一次性经颈静脉注入小鼠,注射后24h摘取心脏,提取总RNA,行Real-time PCR检测NF-κB p65和下游基因ICAM-1、VCAM-1、IL-1a mRNA水平。8.将2ODsiRNA-NC和NF-κB p65 siRNA经in vivo-jetPEI乳化形成的复合物经颈静脉转染小鼠,48h后小鼠心脏移植至大鼠颈部,观察供心存活时间、病理学改变、心脏NF-κB p65的表达和相关粘附分子、细胞因子基因mRNA水平以及大鼠体内诱生抗体移植前后水平变化。结果:1.NF-κB p65 siRNA和阴性对照siRNA均能被阳离子脂质体转染培养细胞,转染效率几近90%。RT-PCR检测发现转染NF-κB p65 siRNA后mRNA的表达水平下调明显,而转染阴性对照siRNA则无干扰效应。2.经尾静脉途径注射,siRNA主要分布于肝脏,心脏和肺分布极少;经颈静脉途径注射则心脏和肺可以获得较多的分布。3.将转染复合物(含2OD siRNA-NC)一次性经颈静脉注入小鼠,结果:在注射后1小时仅肝和肺看到荧光染色,24小时后在心、肺、肝、肾四个器官都看到了荧光染色,并在48h至72h间达到最高,1w时又见减弱。4.将2OD NF-κB p65 siRNA转染复合物经颈静脉注射后第1、3、5、7天的五个时间点监测到NF-κB p65基因表达均受到抑制,沉默效应大于50%,与假手术组和正常小鼠相比P<0.05。5.目的基因NF-κB p65mRNA表达在2OD~4OD剂量组出现明显下调(与1OD组相比较P<0.05),但各组间差别不大(P>0.05),而1OD组表达下降程度轻微(与假手术组相比P>0.05)。6.转染动物均存活,其活力和食欲无任何改变;除了一只小鼠在注射后第一天ALT升高至337U/L,第三天降至正常范围外,所有受试动物的主要生化指标在转染后均未受明显影响。7.剂量为2OD时NF-κB p65 siRNA体内转染小鼠,其心脏NF-κB p65和下游基因ICAM-1、VCAM-1、IL-1a mRNA的表达均下调。8.转染siRNA 48h后,小鼠心脏移植至大鼠颈部。无处理组(单纯将小鼠心脏移植到大鼠颈部)供心平均存活时间为(1.80±0.83)d。对照组(转染siRNA-NC的小鼠心脏移植到大鼠颈部)供心存活时间无延长(与无处理组比较,P>0.05),平均存活时间为(1.60±0.87)d。实验组(转染NF-κB p65 siRNA的小鼠心脏移植到大鼠颈部)见供心存活时间明显延长(与无处理组比较,*P<0.01),移植物平均存活时间为(5.17±1.63)d。9.供心未排斥时,对照组和实验组移植心脏光镜下可见心肌组织排列整齐,部分细胞可见轻度水肿,间质炎症细胞浸润和少量淋巴细胞浸润;电镜下血管内皮肿胀在对照组表现较明显,而实验组表现为部分内皮细胞凋亡。发生排斥时,对照组和实验组供心光镜下见心肌细胞广泛水肿,排列变紊乱,心肌组织间大量的出血,大量炎细胞和少量单个核细胞和淋巴细胞浸润;电镜下实验组和对照组一致呈现部分血管内皮细胞胞质肿胀、粗面内质网增生的激活表现。10.阴性对照组未排斥时供心NF-κB p65 mRNA表达升高,但与正常心肌相比P>0.05;排斥时供心NF-κB p65 mRNA高表达,与正常心肌相比较P<0.05。实验组未排斥时供心NF-κB p65 mRNA表达明显下降,与正常心肌相比较<0.05;排斥时供心NF-κB p65 mRNA仍高表达,但与正常心肌相比较P>0.05。11.阴性对照组供心水平在移植后较正常小鼠心脏明显升高(siNCn VS N, p<0.05; siNCp VS N, p<0.01),且排斥后较排斥前升高更明显(siNCp VS siNCn, P<0.05)。实验组供心VCAM-1 mRNA水平在移植后较正常小鼠心脏明显下降(p<0.01),排斥后表达又明显升高,高于正常水平且与正常心脏相比p<0.01。12.阴性对照组供心移植后ICAM-1 mRNA水平较正常小鼠心脏明显升高(p<0.05),且排斥前后无明显差别(P>0.05)。实验组供心移植后ICAM-1 mRNA水平较正常小鼠心脏明显下降(p<0.05),排斥后表达又升高,但与正常心脏相比别p>0.05。13.阴性对照组供心移植后IL-1a mRNA水平较正常小鼠心脏明显升高(p<0.01),且排斥前后无明显差别(P>0.05)。实验组供心移植后IL-1a mRNA水平较正常小鼠心脏明显下降(p<0.05),但排斥后表达明显升高,与正常心脏相比别p<0.01。14.无处理组(单纯将小鼠心脏移植到大鼠颈部)、对照组(将转染siRNA-NC的小鼠心脏移植到大鼠)、实验组(将转染NF-κB p65 siRNA的小鼠心脏移植到大鼠颈部)三组间受体外周血IgM、IgG水平在移植前、移植后均无明显差异(P>0.05);各组的IgM、IgG水平在移植后较移植前均明显升高(P<0.05)。结论:1.阳离子脂质体Lipofectamine?2000可在小鼠EOMA细胞高效转染化学合成的NF-κB p65 siRNA。2.细胞转染NF-κB p65 siRNA可实现内源性RNA降解,抑制相应的功能蛋白表达;本实验设计针对NF-κB p65的siRNA序列有效,适宜进行体内转染研究。3.颈静脉注射途径是靶向心脏体内转染研究的理想途径。4.颈静脉注射NF-κB p65 siRNA/in vivo-jetPEI复合物能介导ICR小鼠心脏的NF-κB p65基因表达沉默;且获得50%以上沉默效应的siRNA最小剂量为2OD。5. NF-κB p65 siRNA(剂量2OD)转染ICR小鼠后48h至72h心脏siRNA表达最高,是进行心脏移植的最佳时间。6.剂量为2OD时NF-κB p65 siRNA体内转染对ICR鼠是安全的。7.体内转染NF-κB p65 siRNA(剂量2OD)可抑制小鼠心脏NF-κB p65蛋白水平,实现NF-κB下游靶基因转录的有效抑制。8.体内转染NF-κB p65 siRNA(剂量2OD)使小鼠供心存活时间延长。9.体内转染NF-κB p65 siRNA(剂量2OD),小鼠供心未排斥时血管内皮细胞表现为凋亡,而发生排斥时表现为激活。10.体内转染NF-κB p65 siRNA(剂量2OD)可抑制心脏移植后内环境刺激下的供心NF-κB表达和下游基因ICAM-1、VCAM-1、IL-1αmRNA水平。