目的:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是多病因引起的血清淀粉酶、脂肪酶显著升高为特征的胰腺炎症损伤疾病。AP由胆石病、高血脂、酗酒、感染、遗传因素等诱导,发病机制和临床治疗策略均不十分清楚。可引起胰腺炎的病毒包括:流行性腮腺炎病毒、柯萨奇病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒等。柯萨奇病毒中的B3、B4型均可引起胰腺炎,B3型柯萨奇病毒(Coxsackievirus B Type 3,CVB3)感染诱导的病毒性心肌炎研究较为深入广泛,而CVB3诱导的急性胰腺炎的发病机制缺乏研究。CVB3为小核糖病毒科无衣壳正链RNA病毒。经粪口途径感染心脏、胰腺、脑、肝脏等,导致心肌炎、胰腺炎、病毒性脑炎、肝炎等。CVB3诱导急性病毒性心肌炎的机制主要由急性期(0-3天)病毒大量复制直接损伤心肌和心脏局部浸润免疫细胞炎症效应损伤所介导。病毒感染早期心脏局部,固有免疫激活介导的炎症细胞因子、趋化因子分泌及多种免疫细胞(主要为巨噬细胞和T细胞)的浸润,是急性病毒性心肌炎的主要致病细胞;心肌局部M1型巨噬细胞浸润介导的炎症损伤(TNF-α和IL-1β)和后期心脏局部过度的Th1/Th17免疫炎症损伤(IFN-γ和IL-17A),是介导病毒性心肌炎的主要免疫效应机制:NK和γδT细胞等也发挥了重要的早期促炎和调控功能。很多研究证实CVB3感染早期心脏局部上调的IL-17A及IL-17-IL-17RA通路应答在心肌炎和心肌纤维化进程中发挥关键致病作用。胰腺是CVB3感染肠道入血后的首要器官,且胰腺CVB3的复制水平高于心脏,提示CVB3感染的致死首先来自于急性胰腺损伤,其次来自于急性心肌炎。然而迄今,CVB3感染诱导的急性胰腺炎的免疫发病机制未见详尽报道。我们的小鼠预试验发现:1)CVB3在胰腺组织的复制最高,心脏、肝脏次之;第3天的胰腺组织大量坏死主要来自于病毒复制;2)相对于病毒性心肌炎显著的免疫炎症浸润,CVB3感染后的胰腺坏死程度高于免疫浸润损伤;3)急性心肌炎和急性胰腺炎的共同特征是发现感染早期IL-17A的显著上调;IL-17A敲除小鼠感染CVB3后病毒性心肌炎显著减轻、小鼠生存率提高,提示IL-17A及其通路也可能在急性胰腺炎发病中发挥关键作用。IL-17A及IL-17A/IL-17RA通路是已知的感染性和自身免疫性组织炎症损伤的关键核心机制。IL-17A通路所介导的中性粒细胞组织浸润、Th17应答极化及其炎症效应,是其介导组织损伤的主要机制。IL-17A的来源主要有固有免疫细胞(ILC3、γδT、中性粒细胞)、T细胞(Th17)和组织细胞等。我们的预实验发现:病毒感染早期(3天)诱导了胰腺内γδT细胞上调浸润;同时该群细胞分泌较高水平的IL-17A。CVB3感染心肌细胞早期,γδT细胞是分泌IL-17A的主要细胞且促进急性心肌炎的发展。提示γδT细胞主导的IL-17A通路在CVB3诱导的胰腺炎中发挥重要作用。基于以上,我们提出了科学假设:CVB3感染胰腺早期的innate IL-17A可能在病毒性胰腺炎发病中发挥重要促炎作用,γδT是CVB3感染早期胰腺IL-17A的重要分泌细胞,并促进Th17分化及炎症损伤效应。本研究在CVB3感染C57BL/6小鼠诱导的急性胰腺炎模型中,明确胰腺早期IL-17A的分泌动力学;流式细胞术明确innate IL-17A的来源细胞及分泌IL-17A的γδT亚群;通过IL-17A-/-小鼠、TCRδ-/-小鼠、中和单抗和转输试验明确γδT17在CVB3病毒性胰腺炎中的作用;并探讨了 IL-23响应的γδT17促进胰腺Th17炎症效应的可能机制。本研究旨在创新性阐明γδT17及其IL-17A通路在CVB3急性胰腺炎发病中的作用和机制。研究方法:1.C57BL/6小鼠急性CVB3胰腺炎模型的建立:以2000 TCID50剂量CVB3腹腔注射小鼠,7天小鼠死亡率约为30%-60%,体重减轻率为25%,第三天胰腺病毒载量约106 PFU/g。第3～7天可见胰腺腺泡细胞坏死崩解及炎症细胞浸润。2.组织HE染色鉴定心肌炎、胰腺炎病理:胰腺组织经过多聚甲醛固定、脱水、包埋、制备5μm石蜡切片,H&E染色。3.组织病毒滴度测定:胰腺组织20mg,0.5ml PBS匀浆重悬,离心取上清,按1 0-1—1 0-10梯度稀释待用。Hela细胞按80%密度铺96孔板,胰腺匀浆30μl组织样本稀释液加至细胞表面,8复孔,37℃培养1小时,PBS洗三遍,加2%FBS DMEM培养,连续5天观察细胞病变情况。以细胞皱缩、折光性变差、飘起等大于50%视为病变孔。计算组织病毒TCID50/g,乘0.7换算PFU/g。4.胰腺、脾脏、外周血淋巴细胞分离与流式细胞术鉴定:小鼠胰腺组织以胶原酶IV和DNA酶Ⅰ消化,经75%-40%不连续Percoll密度梯度离心分离单个核免疫细胞:脾脏、外周血细胞经去除红细胞和过滤获得单个核细胞。T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、yδT细胞表型分别为CD45+CD3+、CD45+CD11b+Ly6G+Ly6C+、CD45+CD11b+F4/80+、CD45+CD11b+Ly6C+和CD45+CD3+TCRδ+。5.IL-17A+细胞的胞内染色鉴定:单个核淋巴细胞首先经PMA和离子霉素刺激5小时,而后加入Golgi阻断剂作用1小时,收集洗涤后先经表面标志单抗CD4、CD8、TCRδ+、CD11b、Ly6G染色;经固定和穿膜后,再以荧光标记anti-IL-17A、IFNγ、IL-4染色,流式测定。6.中和单抗清除试验:在病毒感染-1和+3天,分别通过尾静脉注射120μg anti-Vγ4单抗,逐天经外周血检测清除效率。7.体外培养和激活Vγ4细胞:Vy4 mAb抗体包板4℃过夜,取单个脾细胞,以anti-CD28(1μg/ml),rmIL-2(2ng/ml)培养基重悬,培养48h后,换rmIL-2(2ng/ml)的新鲜培养基培养;培养第3-4天始有活化γδT细胞出现,调整细胞浓度为0.7-1 ×106/ml。每1.5天更换培养基至第6天。Vγ4γδT细胞得率约2×107/脾。8.体外转输Vγ4细胞试验:WT和TCRδ KO小鼠,在CVB3感染-1和+3天分别通过尾静脉注射106新鲜培养Vγ4细胞,检测输注效率。9.外源注射重组IL-23试验:小鼠尾腹腔注射重组rIL-23(4μg),1天后注射CVB3,观察小鼠发病情况。10.Elisa检测外周血及组织匀浆液细胞因子水平:胰腺组织30mg匀浆,1ml PBS(含有PMSF)重悬,离心取上清。依照eBioscience细胞因子检测试剂盒检测IFNy,IL-1β,IL-6,TNF-α,IL-17A 等蛋白含量。11.脂肪酶活性测定:外周血血清样本、空白(双蒸水),标准品分别与试剂混合均匀,37℃孵育100秒,570nm检测吸光度,根据公式计算样本脂肪酶活力。12.统计学分析:数据采用均数±标准差表示;两组间比较以t-检验;多组间比较以 one-way ANOVA 和 Bonferroni multiple comparison test 分析;生存曲线以Log-rank test 比较;以Graphpad Prism 5统计软件进行分析。结果:1、CVB3感染C57BL/6小鼠诱导了急性病毒性胰腺炎以2000 TCID50的CVB3经腹腔感染C57BL/6雄性小鼠,感染7天体重下降率20%,死亡率为30～60%。第7天小鼠胰腺石蜡切片H&E染色显示:感染小鼠胰腺呈大量胰腺腺胞细胞坏死和炎性细胞浸润,脂肪酶水平明显升高,提示已成功建立了急性AP小鼠模型。2、CVB3急性胰腺炎小鼠胰腺IL-17A水平在感染早期显著升高且IL-17A显著促进了胰腺炎发病程度以ELISA、WB、IHC、IF法检测小鼠胰腺IL-17A水平,发现:CVB3感染后胰腺IL-17A水平显著增高,且在感染第3天达高峰。为证实IL-17A在急性胰腺炎发病中的作用,以CVB3感染IL-17A-/-小鼠,发现:与WT小鼠相比,感染7天IL-17A-/-小鼠体重减轻显著降低,生存率明显提高;病毒滴度无明显变化;胰腺炎性细胞浸润和组织坏死明显改善;胰腺TNF-α等促炎细胞因子水平显著降低;提示IL-17A在急性病毒性胰腺炎发病中发挥关键的促炎作用。3、γδT细胞是CVB3感染早期期胰腺固有IL-17A的主要分泌细胞之一且主要为Vγ4 γδT亚群为明确感染早期胰腺增高的IL-17A的细胞来源,以流式检测CVB3感染小鼠0、3、7天小鼠胰腺浸润免疫细胞。发现:CVB3感染第3天可见胰腺γδT细胞比例显著增高,而CD4+Th细胞比例无明显变化。γδT细胞第3天浸润达高峰(2.2%,104/胰腺),显著高于未感染组(0.8%,103/胰腺);而CD4+Th细胞浸润于第7天达高峰(30%,106/胰腺)。胞内染色鉴定感染早期胰腺IL-17A+细胞类型,发现:感染3天,胰腺CD3+T细胞系分泌IL-17A的主要细胞。比较CD3+T中CD4+T、CD8+T、γδT、NKT 细胞发现:感染第 3 天 CD8+T(0.08%)和 NK(0.02%)几乎不分泌IL-17A,而CD4+T(0.24%)和γδT(0.31%)是分泌IL-17A的主要细胞;30%以上的γδT细胞分泌IL-17A,而仅6%的CD4+T分泌IL-17A(p<0.05),提示CVB3感染胰腺早期增高的IL-17A主要由γδT和CD4+T分泌,γδT分泌效率显著高于CD4+Th17。检测γδT细胞亚群发现:γδT亚群Vγ1和Vγ4浸润比例和绝对数相当;而第3天胰腺分泌IL-17A的γδT主要是Vγ4细胞亚群。4、CVB3感染TCRδ-/-小鼠诱导的急性胰腺炎显著减轻为证实γδT细胞在CVB3急性胰腺炎发病中的作用,以CVB3感染TCRδ-/-小鼠,发现:γδT细胞缺失后,小鼠CVB3胰腺炎发病显著降低,胰腺细胞坏死和炎症浸润显著减少;胰腺IL-17A、TNF-α和IL-6水平均显著降低;病毒载量无变化。提示γδT细胞在胰腺炎发病中发挥致病作用。5、以中和抗体清除Vγ4 γδT细胞显著减轻CVB3急性胰腺炎发病为证实CVB3感染胰腺早期分泌IL-17A的Vγ4 γδT细胞亚群的作用,以Vγ4中和抗体于-1、+3天尾静脉注射小鼠清除体内Vγ4细胞,0天感染CVB3。结果显示:Vγ4中和抗体清除90%以上外周血Vγ4 γδT;清除Vγ4γδT使CVB3感染小鼠诱导的急性胰腺腺泡细胞坏死和炎症浸润显著减少;胰腺IL-17A、TNF-α、IL-6和IFN-γ水平显著降低;提示Vγ4 γδT细胞在CVB3急性胰腺炎发病中发挥促炎作用。6、过继转输Vγ4 γδT细胞显著加重CVB3病毒性胰腺炎体外诱导培养正常和IL-17A-/-小鼠来源的Vy4 γδT细胞,以106细胞/只小鼠尾静脉回输TCRδ-/-小鼠,1天后感染CVB3,发现:向发病减轻的TCRδ-/-小鼠回输Vγ4 γδT可显著加重病毒性胰腺炎发病,而回输IL-17A-/-来源Vγ4 γδT,则急性胰腺炎发病显著减轻。提示Vγ4 γδT所分泌的IL-17A确实在CVB3感染诱导的急性胰腺炎发病中发挥关键促炎作用。7、IL-17A+Vγ4 γ8T细胞加重CVB3病毒性胰腺炎的机制与其促进中性粒细胞胰腺浸润、促进Th17炎症应答相关IL-17A-IL-17RA通路的效应之一是趋化中性粒细胞的器官浸润。流式检测发现:CVB3感染第3天诱导了胰腺中性粒细胞的大量浸润。而TCRδ-/-、IL-17A-/-小鼠及中和抗体清除了 Vγ4的感染小鼠胰腺中性粒细胞浸润比例和数目显著减少。清除Vγ4 γδT的小鼠外周血中性粒细胞被显著抑制90%,其向胰腺的浸润被显著抑制80%以上。提示胰腺早期浸润的IL-17A+Vγ4γδT细胞,显著促进中性粒细胞胰腺浸润并发挥促损伤功能。其次发现:清除Vγ4γδT小鼠脾脏及外周血的IFNγ+CD4+T(Th1)细胞比例及绝对数明显增加,而IL-17A+CD4+T(Th17)细胞的比例及绝对数明显减少;提示Vγ4 γδT细胞分泌的IL-17A通过抑制Th1应答、促进Th1 7炎症应答加剧病毒性胰腺炎。8、感染早期胰腺上调的IL-23激活浸润IL-23R+Vy4 γδT细胞向γδT17分化从而促进CVB3诱发的急性病毒性胰腺炎为明确感染早期激活胰腺γδT细胞的机制,发现:CVB3感染极早期(day1)胰腺显著上调IL-23表达,而γδT细胞组成型高表达IL-23R,为证实IL-23-IL-23R通路对胰腺早期浸润Vγ4 γδT细胞的激活,对WT、TCRδ-/-小鼠外源腹腔注射IL-23,1天后感染CVB3,发现显著加剧WT小鼠急性胰腺坏死及炎症浸润,而不改变TCRδ-/-小鼠胰腺病理;同时,rIL-23显著增高注射12小时后体内胰腺诱导的IL-17A+γδT(而非Th17)比例。提示CVB3感染早期上调的胰腺局部IL-23,经由IL-23R通路激活Vγ4 γδT细胞分泌IL-17A,从而促进病毒性胰腺炎病理。结论:1、CVB3感染C57BL/6小鼠第7天诱导了以胰腺腺泡细胞坏死、免疫浸润和血清胰酶增高为特征的急性病毒性胰腺炎。2、CVB3感染诱导小鼠胰腺早期(day1～3)上调表达IL-17A且其显著促进CVB3感染诱导的急性胰腺炎发病。3、感染早期胰腺分泌IL-17A的主要细胞为Vγ4γδT17和CD4+Th17细胞,但γδT17先于CD4+T浸润胰腺、且其分泌IL-17A的效率显著高于Th17。4、γδT细胞敲除小鼠经CVB3诱发的急性胰腺炎发病显著减轻。中和抗体清除Vγ4 γδT细胞后感染CVB3诱导的急性胰腺炎发病显著减轻。过继转输IL-17A+Vγ4 γδT显著加重CVB3诱导的急性胰腺炎;而转输IL-17A-/-来源的Vγ4 yδT细胞则使加重的胰腺炎显著减轻,提示Vγ4 γδT来源的固有IL-17A促进CVB3诱发的急性病毒性胰腺炎。5、IL-17A+Vγ4 γδT细胞加重CVB3病毒性胰腺炎的机制与其促进γδT17分泌的IL-17A对于嗜中性粒细胞胰腺浸润、促进Th17炎症应答相关。6、感染早期胰腺上调的IL-23经IL-23R通路激活浸润Vγ4 γδT细胞分泌IL-17A从而促进CVB3诱发的急性病毒性胰腺炎。