原发性肝癌（主要为肝细胞癌,HCC,简称肝癌）在全球恶性肿瘤死因中居第3位,在我国更高居第2位。尽管肝癌临床和基础研究均取得了长足的进步,但其总预后并无显著改善。即使根治性切除5年复发转移率仍高达60-70%;局部治疗则更高。为此,转移复发已成为进一步提高疗效的瓶颈。传统的研究注重癌细胞自身,对宿主及局部微环境研究较少。近年发现宿主微环境对肿瘤演进起着重要作用。目前已认识到癌转移是肿瘤细胞和宿主微环境之间相互作用的过程,后者能影响肿瘤的生物学特性并促进或抑制肿瘤细胞在靶器官的定居。随着芯片技术等高通量研究方法的涌现,大量来源于微环境、参与肿瘤器官特异性转移的分子、基因表达谱及信号通路等被发现。宿主微环境中,复发转移靶器官的微环境是影响复发转移是否发生的决定性因素之一,癌细胞只有在适合的靶器官微环境中才能生长,形成了肿瘤转移复发的“器官特异性”,百年前Paget以“种子与土壤”理论对此做了精辟的总结。在宿主因素中,许多是与炎症/免疫相关的因素,靶器官的炎症/免疫反应对患者预后有重要影响,但有双向调节的特性。如能增强不利于肿瘤转移的靶器官炎症状态或削弱有利于转移形成的状态,当可降低转移的发生。但前提是需判断靶器官处于何种炎症/免疫状态,以及何种状态可促转移或抑转移,否则干预措施将是盲目的。有乙型或丙型肝炎病毒感染背景的肝癌,是研究炎症与癌症关系的重要对象。肝脏有独特的免疫系统并参与局部及整体水平炎症、免疫调节。肝内不仅定居着大量的淋巴细胞,还有许多炎症相关细胞,这其中肝星状细胞在肝脏炎症反应向纤维化和癌变转化的整个过程中都起着重要做用。肝内的炎症及炎症相关细胞在生理状态下通过与循环中的淋巴细胞的相互作用,使肝内的炎症/免疫反应处于动态平衡中。而在病毒感染等病理情况下,它们会引起肝脏炎症反应的慢性迁延以及由此产生的纤维化甚至癌变。我所前期研究发现肿瘤内的炎症/免疫反应状态能影响肝癌细胞侵袭转移潜能,从而影响预后。肝癌根治性切除后余肝是术后转移复发的主要靶器官,癌旁肝组织很好的代表了残余肝,为此癌旁肝炎症状态应具有预后价值。已有研究提示癌旁肝组织的免疫状态与肝癌门静脉播散相关。但目前尚无针对癌旁炎症免疫状态的系统研究,也没有简便可靠的判断指标,从而无法给予治疗以准确的监测与指导。综上所述,针对肝脏炎症的治疗,当有助抑制肿瘤复发转移。根据“种子与土壤”的观点,在针对肝脏炎症的同时,还应针对肿瘤细胞,才能发挥更大作用。干扰素-α（interferon-α,IFN-α）既有治疗乙型和丙型肝炎病毒的作用,减轻炎症反应;又有抑制肿瘤细胞增殖、侵袭转移的作用;并已被证实对肝癌术后患者有预防或延迟复发的作用。但干扰素治疗又有明显的不足:一方面患者常需大剂量使用,易引起明显的副作用,使患者的依从性降低;另一方面,IFN-α在诱导细胞凋亡的同时,也能促进细胞存活;对于肾癌、膀胱癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤等更存在针对IFN-α的耐药性,这种耐药性可能与其诱导环氧化酶2（COX-2）表达上调有关。通过联合使用中药姜黄素或COX-2抑制剂（如塞来考昔）等,能逆转IFN-α上调的COX-2表达,提高其疗效。IFN-α对肝癌也存在耐药性,仅对部分术后肝癌患者有效。因此有必要寻找减少干扰素用量,同时能提高其疗效的方法。COX-2抑制剂塞来考昔等虽可选用,但有心血管反应等副作用,因此其临床使用受到限制。中药制剂通常作用温和、副作用较小,其中氧化苦参碱（苦参素,oxymatrine）是临床常用的清热解毒药,已被用于抗乙肝的治疗,能抑制病毒复制,效果与IFN-α相似;又有调节免疫、抗肝纤维化等作用、抗肿瘤等作用。体外实验发现其能抑制肝痛细胞的增殖、促进凋亡。为此氧化苦参碱也具有调节炎症反应和抗肿瘤细胞的双重作用,故小剂量IFN-α联合氧化苦参碱可能有较好的临床效果。COX-2表达的上调可能是进一步提高干扰素对肝癌疗效的瓶颈,但尚无相关研究。研究提示,在慢性肝病患者中COX-2可调节炎症局部T淋巴细胞和巨噬细胞的浸润;促进慢性肝炎向肝纤维化/肝硬化的转变;COX-2更是慢性肝炎反应向肝癌转变的重要参与者和调控者,癌变过程中HBV基因组向宿主肝细胞内的整合需要COX-2的参与;选择性的抑制COX-2则能抑制肿瘤的进展并有一定的预防疗效。但COX-2对于肿瘤和炎症反应来说是一把双刃剑,既能促进肿瘤生长、加剧慢性炎症反应,又能抑制肿瘤生长,抑制慢性炎症反应。目前尚无癌内COX-2与肝癌预后的研究。所以必须首先明确COX-2与肝癌侵袭转移及预后的关系,才能以此为基础研究其在肝癌干扰素治疗中的作用。本文目的是:阐明肝脏炎症与肝癌转移的关系,探索小剂量IFN-α为基础的干预措施;明确COX-2与肝癌转移、预后以及小剂量IFN-α疗效的关系,以提高IFN-α疗效。关于判断肝脏炎症反应状态,本文从两方面入手:一是以临床易行的外周血中与肝脏炎症密切相关的γ-谷氨酰转肽酶（GGT）和谷氨酸氨基转移酶（ALT）为对象;二是以有助说明机理的癌旁肝组织中重要的炎症相关细胞为对象。方法上用组织微阵列免疫组化技术和荧光定量PCR技术,原位、在体探索活化肝星状细胞、肥大细胞、Foxp3+调节性T细胞和巨噬细胞等的分布、数目及相关基因表达与肿瘤转移的关系。关于干预,本文进行了以小剂量IFN-α为基础的干预研究。第一部分外周血γ-谷氨酰转肽酶、谷氨酸氨基转移酶与肝癌患者术后预后目的:寻找临床可用、简便易行的反映肝脏炎症和肝癌预后的预测指标。方法:随机选取了2002年1月—2006年12月,219例在复旦大学附属中山医院行根治性手术切除的肝细胞癌患者。除肝癌外,所有患者术前无其他影响GGT和ALT水平的疾病,肝功能Child-Pugh分级均为A级,均在术前两天采集外周静脉血检测肝功能。GGT或ALT分别分为高低两组（GGT的分界值为60IU/L,ALT的分界值为80IU/L）,比较高低GGT或ALT组患者的术后生存时间（OS）和至复发时间（TTR）的差异。还计算了GGT与ALT的比值（GGT/ALT）,并将其按最佳分界值（恰为其平均值）分为高低两组,同样比较了两组间OS和TTR的差异。结果:外周血GGT与ALT之间具有显著的线性正相关（r=0.411,P＜0.001）,但当将GGT和ALT都分为高低两组后,多数患者的GGT处于高水平（n=110）而ALT处于低水平（n=185）。GGT越高,患者肿瘤越大,BCLC分期越晚,越有可能发生血管侵犯。而ALT则与肿瘤临床病理特征无明显相关性。而GGT/ALT表现出与肿瘤病理特征更为紧密的联系,其高低与肿瘤大小、有无包膜、有无血管侵犯、BCLC分期都显著相关。生存分析发现,GGT仅与OS具有独立的相关性（P=0.002）,ALT与TTR和OS都无相关性;而GGT/ALT与TTR和OS均独立负相关（P值分别为0.002和小于0.001）。重要的是GGT/ALT越高者越容易发生术后早期肝内复发（P＜0.05）和复发相关死亡（P＜0.01）,而与术后晚期复发及非复发相关死亡的发生无明显相关性。将患者按术前血清甲胎蛋白（AFP）高低分为两组后,GGT/ALT在这两组病人中,仍具有一定的预后预测能力,通过受试者工作曲线（ROC）分析,发现GGT/ALT预测预后的能力高于AFP。结论:以外周血GGT和ALT联合分析（GGT/ALT）为指标判断肝脏炎症反应状态能较好地预测肝癌患者的术后预后。鉴于GGT和GGT/ALT与肿瘤临床病理特征紧密相关,GGT/ALT也与早期复发相关,为此这些指标不仅可反映肝脏炎症状态,也能反映患者肿瘤负荷（如大小,有无播散等）。提示肝脏炎症反应与HCC的复发转移相关,以GGT或GGT/ALT为指标,有助筛选术后复发高危患者并给予干预,有助监测治疗后肿瘤负荷和肝脏炎症的动态变化,并指导治疗的调整。第二部分癌周炎症（相关）细胞与肝癌患者术后预后目的:研究有助反映肝脏炎症和肝癌预后的癌旁肝组织中重要相关细胞,作为术后更确切的预测指标。方法:随机选取2002年2月—2005年11月,130例（队列A）和2002年1月—2006年12月,207例（队列B）两组在复旦大学附属中山医院行根治性手术切除的肝细胞癌患者。队列A:首先通过组织微阵列,利用免疫组化染色和细胞数目绝对定量,原位、在体地评价了癌旁微环境中αSMA+活化的肝星状细胞（aHSC）的数目、分布、功能状态与术后肿瘤复发转移及肿瘤侵袭能力指标之间的联系;然后利用荧光定量RT-PCR,检测这130例患者癌旁冰冻标本中主要由aHSC表达的功能基因包括粘蛋白-C（TNC）、骨连接素（SPARC）和纤维母细胞活化蛋白（FAP）的表达量,以及上述功能基因与肝癌患者术后预后的关系。队列B:利用组织芯片、免疫组织化学技术,绝对计数癌旁tryptase+肥大细胞（MC）的数目、分布、功能状态与术后肿瘤复发转移及肿瘤侵袭能力指标之间的联系。在队列A和队列B中,通过免疫组织化学和细胞绝对计数方法,研究了癌旁Foxp3+调节性T细胞（Treg）、CD68+巨噬细胞（MΦ）等炎症免疫相关细胞的数目、分布和功能状态与肝癌患者预后的关系,以及aHSC、MC与Treg、MΦ等在数量和功能上的关系。结果:（1）癌旁Treg和MΦ的数量与aHSC数量成正相关。（2）aHSC功能基因FAP、SPARC和TNC的表达水平之间存在显著的正相关,而且它们的表达水平都与aHSC数量正相关（r分别为0.903、0.634和0.887,P＜0.001）;与正常肝组织相比,癌旁肝组织的上述功能基因的表达量更高。（3）癌旁aHSC数量（r=0.176,P=0.04）与功能基因（FAP）（r=0.204,P=0.02）表达水平与外周血GGT/ALT水平正相关;癌旁aHSC数量、FAP和SPRAC的表达量都与外周血GGT含量正相关（r分别为0.222、0.287和0.174,P分别为0.011、0.001和0.047）。（4）癌旁aHSC在数量和功能基因的表达量上,都与肝癌恶性临床病理特征正相关。（5）癌旁aHSC的数量与功能基因的表达高低都与术后生存和复发相关,即数量高或功能基因表达高者术后生存时间短,更易复发;同样癌旁Treg和MΦ也是患者预后的独立预测指标。（6）癌旁aHSC的数量与功能基因表达量、Treg及MΦ数量联合后,具有更好的预测能力。（7）癌旁aHSC的数量与功能基因表达高者更易发生早期复发,而对晚期复发无显著影响。（8）癌旁MC与癌旁Treg在数量上存在显著的正相关性（r=0.353,P＜0.001）。（9）MC数量与外周血GGT/ALT含量正相关（r=0.146,P=0.036）。（10）MC单独使用时,仅能独立地预测术后复发,而与总生存时间无关;在联合Treg分析后,其预后价值显著提高,癌旁MC和Treg同时高的患者预后显著差于MC和Treg都低者。而且MC数量的高低与早期复发相关,而与晚期复发无关。（11）MC的数量与肿瘤临床病理特征相关,MC越多,肿瘤越大,越有可能没有完整的包膜。结论:（1）肝癌癌旁微环境aHSC在细胞水平和基因水平均可作为患者术后复发转移和总生存时间的预测指标。癌旁aHSC能通过表达功能基因如FAP、SPARC等,加剧肝脏炎症反应,诱导Treg和MΦ在癌旁肝组织聚集,形成有利于播散肿瘤细胞定居的炎症免疫环境,增加播散肿瘤细胞侵袭转移活性,更易形成早期肝内复发。当aHSC的数量与其功能基因或其他炎症/免疫细胞联合后,具有更好的预测价值,提示活化的aHSC主要通过调节肝脏炎症/免疫反应来加速肝癌术后复发转移。以aHSC为靶点的抗炎/免疫调节治疗具有潜在预防复发转移、改善预后的价值。（2）癌旁MC也可通过调节炎症免疫反应,形成有利于肝癌复发转移的土壤,促进播散肿瘤细胞的侵袭转移。（3）癌旁aHSC在细胞数量和功能基因的表达水平上与外周血GGT和/或GGT/ALT水平成正相关;癌旁MC数量与外周血GGT/ALT水平正相关。提示以癌旁炎症相关细胞（活化的肝星状细胞、肥大细胞等）来判断肝癌患者的肝脏炎症反应,和以外周血肝酶（GGT和GGT/ALT）判断患者肝脏炎症状态,其预测结论一致,从而反证简便易行的GGT和GGT/ALT的预测价值。我们认为,通过两方面的综合分析更能客观地反映肝脏炎症反应的状态。第三部分环氧合酶-2与肝癌侵袭转移潜能和预后的关系目的:验证环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）与肝癌细胞侵袭转移潜能和肝癌预后的关系,为进一步研究小剂量IFN-α的疗效,及其疗效与COX-2的关系打下基础。方法:以不同侵袭转移潜能的七种肝癌细胞株和随机选取的根治性肝癌切除术后患者为研究对象（排除晚期、肝外复发转移）,通过Western-blot和荧光定量PCR技术,分别测定肿瘤细胞和肿瘤组织内COX-2的表达,分析COX-2表达与肿瘤细胞侵袭转移潜能和肿瘤患者预后的关系。结果:（1）随着肿瘤细胞侵袭转移潜能的降低,其COX-2表达量同步减少。（2）肝癌组织COX-2 mRNA表达高低与主要临床病理特征无显著联系。（3）肿瘤内COX-2表达越高,患者复发和死亡的危险越高,P值分别为0.025和小于0.001,危险度分别为1.916（1.086-3.380）和3.522（1.985-6.248）。结论:COX-2高表达促进肝癌侵袭转移潜能,加速早期肝内复发,使预后恶化。如干扰素能抑制肝癌表达COX-2,则能抑制其侵袭转移,降低复发;反之,则增强肝癌侵袭转移,造成不良预后。第四部分小剂量干扰素单用或联合氧化苦参碱对MHCC97-H细胞侵袭转移潜能的影响及可能的机制目的:根据“种子与土壤”的观点,理想的干预应既可调节肝脏炎症又能抑制肿瘤。IFN-α虽被证实可预防术后复发转移并有抗炎免疫调节作用,但较大剂量使用其副作用明显。本研究拟通过体外试验,探索小剂量干扰素作为基础干预的可能性,以及提高其疗效的途径。方法:研究小剂量IFN-α对高转移潜能人肝癌细胞MHCC97-H的作用,并研究氧化苦参碱与之合用后是否有更强的抑瘤作用。根据文献,干扰素小剂量标准为1×10³U/ml,我们研究该剂量干扰素对MHCC97-H细胞体外增殖、凋亡、侵袭转移能力的影响。同时,研究了小剂量干扰素与氧化苦参碱联合使用后对MHCC97-H的作用,以明确氧化苦参碱与干扰素之间是否具有协同的抗肿瘤作用及可能机制。结果:（1）小剂量干扰素体外对MHCC97-H细胞的增殖抑制能力不显著,且不随时间增加;不能显著的诱导MHCC97-H细胞凋亡,且不随时间延长而增加;不能明显抑制MHCC97-H细胞体外侵袭转移潜能。（2）氧化苦参碱对MHCC97-H细胞具有一定的增殖抑制能力,且随浓度增加而增加,其IC₅₀=44.5mg/ml,为了避免选择较高增殖抑制能力的氧化苦参碱浓度而掩盖了后面判断联合用药的效果,我们选择具有较小增殖抑制能力的氧化苦参碱浓度=10mg/ml作为进一步实验的浓度。（3）联合用药后,对MHCC97-H细胞的增殖抑制能力显著增强,且随作用时间延长而增加;并能显著地诱导MHCC97-H细胞凋亡,同样随时间延长而增强;亦能有效地降低MHCC97-H细胞的侵袭转移能力。（4）机制:小剂量干扰素具有上调肿瘤细胞COX-2表达的作用,而氧化苦参碱则能抑制COX-2表达,两者联合用药后,小剂量干扰素所上调的COX-2表达亦被有效抑制。结论:小剂量干扰素体外对MHCC97-H细胞没有明显抑制增殖、促进凋亡和降低侵袭力的作用,这与其上调COX-2表达有关;而合用氧化苦参碱后,其作用增强,且伴COX-2表达的显著下调。说明氧化苦参碱通过逆转由小剂量干扰素上调的COX-2表达而产生协同抗肿瘤作用。提示两者的联合可能降低干扰素的耐药性,减少干扰素使用剂量。第五部分体内小剂量干扰素单用或联合氧化苦参碱对肝脏炎症状态的影响及对原位MHCC97-H种植瘤的作用目的:通过高转移人肝癌裸鼠模型进一步在体内验证小剂量干扰素合用氧化苦参碱对肿瘤和肝脏炎症的作用。方法:采用高转移人肝癌细胞系MHCC97-H裸鼠原位移植模型。干扰素用量为1×10⁶U/ml,0.1ml/d皮下注射;氧化苦参碱为60mg/kg·d,腹腔注射。裸鼠分4组:空白组（n=12）皮下及腹腔注射生理盐水62天;干扰素组（n=8）腹腔注射生理盐水,皮下干扰素,连续62天;氧化苦参碱组（n=8）皮下注射生理盐水,腹腔氧化苦参碱,连续62天;联合治疗组（n=6）皮下干扰素加腹腔氧化苦参碱62天。动物若在治疗期间死亡（对照组3只,干扰素组2只,氧化苦参碱组2只,联合治疗组无死亡）视为观察终点,用于比较生存期;动物存活至治疗结束者,处死前取外周血检验肝功能,处死后取组织标本行相应实验。另设同样四组,每组12只裸鼠,用于观察生存期,故最后观察生存期的各组裸鼠数量分别为:空白组15只,干扰素组14只,氧化苦参碱组14,联合治疗组12只,最长生存时间为97天。结果:（1）小剂量干扰素组裸鼠体重有下降趋势,但差别不显著;氧化苦参碱则有增加裸鼠体重的趋势;两者合用后,裸鼠体重明显增加。（2）就种植肿瘤的体积而言【与对照组比较（3.056±0.649cm³）】,小剂量干扰素组肿瘤最大（6.410±1.854cm³,P=0.055）,而联合用药组肿瘤最小（0.382±0.269cm³,P=0.007）。（3）与对照组相比,仅联合治疗组的肺转移率显著下降（P=0.011）;但计算肺转移灶个数后,发现氧化苦参碱组（P=0.02）和联合治疗组（P=0.008）的肺转移个数均显著少于对照组,而小剂量干扰素组则显著增加（P=0.018）。（4）联合治疗组的生存时间显著长于其他各组,而小剂量干扰素组未能提高生存时间,氧化苦参碱组与小剂量干扰素组相比无显著差异。（5）小剂量干扰素作用后,外周血GGT和GGT/ALT均显著提高,而联合治疗组则显著降低。（6）各组外周血GGT及GGT/ALT均与其肿瘤大小正相关。（7）癌旁和癌内活化的HSC在小剂量干扰素组数量最多,联合治疗组数量最少。（8）癌内COX-2的表达在对照组和小剂量干扰素组较高,而在氧化苦参碱组和联合用药组则明显降低。结论:（1）小剂量干扰素不能抑制移植瘤生长,反增加肺转移灶数目,未能延长生存期。合用氧化苦参碱能显著抑制移植瘤的生长和肺转移,延长生存期。（2）可能的机制:A、抑制肝脏炎症反应,联合用药后外周血GGT、GGT/ALT显著降低,而小剂量干扰素则使之提高;且GGT、GGT/ALT在各组均与肿瘤大小正相关,说明GGT/ALT或GGT能反映体内肿瘤负荷。联合治疗组癌旁及癌内的aHSC数量减少,提示肝脏炎症反应程度降低。B、抑制肿瘤侵袭转移能力:联合用药后肺转移率和转移灶个数都显著降低。可能因氧化苦参碱能逆转小剂量干扰素诱导的肿瘤细胞COX-2表达,从而抑制肿瘤侵袭转移能力,降低肺转移率。而COX-2通路又是炎症反应中的重要通路之一,故两药联合在抑制肝脏炎症反应方面同样具有协同作用。为此,体内研究证明,联合用药通过苦参碱逆转由小剂量干扰素诱导的COX-2,从而更有效地抑制炎症反应并抑制肿瘤。结论1.肝脏炎症状态对于HCC患者具有重要的预后价值。通过研究外周血GGT和GGT/ALT,以及癌旁炎症相关细胞的数量和功能状态,均能反映肝脏的炎症反应状态,并预测患者的预后,两者结论一致。前者简便易行,还可连续监测治疗并指导其调整。后者有助说明机理,并为治疗提供潜在的靶点。2.小剂量干扰素的抗瘤和抑制肝脏炎症的作用不明显。小剂量干扰素与氧化苦参碱合用则显著抑制肝癌的生长和侵袭转移,与氧化苦参碱能逆转由小剂量干扰素上调的COX-2表达有关。3.联合用药更能显著地降低外周血GGT,GGT/ATL水平和癌旁活化HSC数量,从而改善肝脏的炎症状态,形成不利肿瘤生长之环境,抑制转移复发形成。创新点1.首次发现和报道了肝癌患者外周血GGT/ALT与术后复发转移的密切关系,该比例可以作为连接肝脏炎症反应与肿瘤负荷的桥梁,作为筛选高危患者、及时进行术后干预的指标,也可作为术后炎症免疫调节治疗的监测指标。（Journal ofGastroenterology 2009）2.首次发现和报道了肝癌癌旁微环境中活化肝星状细胞（Am J Clin Pathol2009）和肥大细胞（Cancer Science 2009）与术后复发转移和生存时间的密切联系,同样有助于筛选高危复发患者,并提供了术后干预治疗的靶点。3.通过体内外实验,首次发现氧化苦参碱与小剂量干扰素合用,可抑制肝脏炎症反应并抑制肝癌的生长与侵袭转移,其协同作用与氧化苦参碱能逆转小剂量干扰素所诱导的COX-2表达有关。而小剂量干扰素既不能抑制肝癌生长、侵袭和转移,又不能调节肝脏炎症反应。潜在应用价值1.外周血GGT/ALT比例及癌旁以活化肝星状细胞和肥大细胞为代表的炎症（相关）细胞都能较好地反映肝癌患者肝脏炎症状态,并与术后复发转移和生存密切相关,可用于临床筛选高危复发患者、指导和监测术后治疗。2.不能有效的改善肝脏炎症状态是小剂量干扰素抗肿瘤、抑制复发转移疗效局限的重要原因之一。小剂量干扰素联合氧化苦参碱可作为肝癌术后又一辅助治疗的方案。