果糖基转移酶具有转糖基作用，是能够催化果糖基单元从一个蔗糖分子转移到另一个蔗糖的一类酶。三氯蔗糖是人类开发的一种最完美的强力甜味剂，蔗糖-6-乙酸酯在三氯蔗糖合成中非常重要。生物酶法合成蔗糖-6-乙酸酯成为近年来研宄的热点，果糖基转移酶可以以蔗糖与葡萄糖-6-乙酸酯为底物，催化合成蔗糖-6-乙酸酯。该方法具有高效性、专一性、且副产物较少等优点，因此有极大的应用潜力。　　在前期试验中，我们从米曲霉ZZ-01发酵液的中筛选到一种新型的果糖基转移酶AoFT，并且发现该酶能够催化合成蔗糖-6-乙酸酯的。本研宄首先将来自米曲霉中表达果糖基转移酶AoFT的基因在大肠杆菌中表达，然后对大肠杆菌表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT的酶学性质进行研宄。由于大肠杆菌是胞内表达体系，产物分离纯化步骤较为复杂，我们又将米曲霉果糖基转移酶AoFT的基因在毕赤酵母中克隆表达，并对毕赤酵母表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT酶学性质进行研宄，对比分析毕赤酵母与大肠杆菌不同表达系统表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT酶学性质的差异，通过分析毕赤酵母表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT糖基化位点的不同，解释酶学性质变化的原因。　　具体研宄内容如下：　　(1)通过RACE-PCR的方法，从米曲霉ZZ-01中克隆到果糖基转移酶AoFT基因，并分析果糖基转移酶基因序列的特性。构建重组质粒pET22b-AoFT，将重组质粒pET22b-AoFT转化至E.coli BL21感受态细胞中构建工程菌，利用IPTG诱导，使目的蛋白表达，收集菌体并经过超声破碎、离心和镍柱亲和层析纯化等分离纯化蛋白，得到目的蛋白，然后进行酶活力的测定。　　(2)米曲霉果糖基转移酶AoFT的催化特性研究。包括最适反应温度、最适pH和热稳定性，以及金属离子、有机溶剂、表面活性剂、还原剂和蛋白抑制剂等对米曲霉果糖基转移酶AoFT活性的影响。　　(3)将重组质粒pET22b-AoFT双酶切获得AoFT基因，并与pPICAαA质粒构成pPICAαA-AoFT重组质粒，经如Sac I酶切线性化后电转入毕赤酵母X33中，得到X33工程菌，甲醇诱导表达目的蛋白，收集发酵液并经过硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析等步骤纯化获得目的蛋白，然后进行酶活力测定。　　(4)对比分析毕赤酵母与大肠杆菌不同表达系统表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT酶学性质的不同(温度，pH等）；通过分析毕赤酵母表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT糖基化位点的不同，解释酶学性质变化的原因。　　实验结果表明：　　(1)重组基因工程菌E.coli BL21经IPTG诱导能够表达目的蛋白酶米曲霉果糖基转移酶AoFT，SDS-PAGE结果显示该目的蛋白分子量约68KDa,与预期结果相符，纯化回收率达到33.6％，比活力为65.8U/mg。　　(2)大肠杆菌表达的米曲霉果糖基转移酶AoFT最适反应温度和最适反应pH分别为50℃和6.0。在温度范围30-50℃处理1小时可以保持80%以上活性；果糖基转移酶AoFT还具有较髙的pH稳定性，在pH5.0-7.0之间处理1小时可以保持80%活性以上。此外，该酶对大多数的金属离子、表面活性剂(Tween20、Triton-X100)和有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、甲醛、DMF、DMSO等）具有较好的抗性。变形剂SDS和尿素对该酶活性抑制作用较强，但是该酶转糖基活性不受EDTA抑制，表明该酶不是金属酶。　　(3)重组基因工程菌X33经甲醇诱导表达果糖基转移酶AoFT,SDS-PAGE结果显示该目的蛋白分子量约90KDa,纯化回收率达到70.6%，比活力为71.41U/mg。该酶最适反应温度为45℃，在20-60℃范围内，热处理1h后该酶仍保持50%以上的活性；最适pH为5.5，且在pH4.0-7.0范围内相对酶活均在60%以上。大多数金属离子、常见表面活性剂和EDTA对酶活影响不明显，并且该酶对有机溶剂有较好的抗性。此外，还原剂DTT对酶活性有抑制作用，且浓度越大抑制作用越强；高浓度的酶抑制剂对该酶具有较强的抑制作用。　　(4)来自毕赤酵母表达的果糖基转移酶AoFT比来自大肠杆菌表达的果糖基转移酶AoFT酶活力高，酶学性质相似，但更接近于天然的果糖基转移酶AoFT，这是因为毕赤酵母表达系统对目的蛋白进行翻译后高水平的修饰和加工，一些糖基化修饰的结果。