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丙泊酚是一种快效、短效静脉麻醉药。由于其具有苏醒迅速而完全,持续输注后无蓄积等特点,因此目前普遍应用于麻醉诱导、麻醉维持,也常用于麻醉中、手术后与ICU病房的镇静。除了其常规的催眠、镇静等麻醉效能以外,在非麻醉效能方面,最受人们关注的就是丙泊酚的抗炎,保护效应。我们在前期研究发现丙泊酚具有抗炎作用的基础上设计了本课题。第一章 丙泊酚对内毒素致离体大鼠肠上皮细胞损伤及炎症细胞因子的影响目的：对比丙泊酚与乌司他丁对LPS诱导离体大鼠肠上皮细胞炎症细胞因子水平的影响以探讨丙泊酚抗炎作用的强度。方法：复苏IEC-6细胞,加DMEM高糖培养基(内含2mM L-glutamine)、 15mM HEPES10%胎牛血清,1OOU/ml青霉素,100μg/ml链霉素,传代2次,观察细胞形态与ACCA细胞库提供细胞形态相同,可以用于细胞实验。将细胞分为①内毒素组(L组)、②内毒素+丙泊酚组(L+P组)、③内毒素+乌司他丁(L+U组)、④空白对照组(C组)、⑤丙泊酚对照组(P组)、⑥乌司他丁对照组(U组).将细胞随机分组后分别给予相应干预措施后采用MTT实验评价各组细胞相对活力。应用ELISA法检测细胞培养液炎症细胞因子浓度。所有数据采用SPSS13.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差(X±s)表示,所有计量资料间比较满足方差齐性,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),多重比较采用LSD(Least-significant difference test)法,方差不齐则采用Welch法,多重比较采用Dunnetts T3检验。P≤0.05为差异有统计学意义。结果：L组细胞OD值显著低于对照组(P<0.001)；L+P组与L组比较差异有统计学意义(P<0.001),与C组比较差异无统计学意义(P=0.367)；而L+U组与L组比较差异无统计学意义(P=0.260)；L+P组与L+U组比较差异有统计学意义(P<0.001)。各组细胞培养上清液中IL-1p、IL-6、TNF-α检测结果如下：IL-1p检测值统计结果显示L组与C组比较差异有统计学意义(P<0.001),P组、U组与C组比较差异无统计学意义(P>0.50),P组与U组比较差异无统计学意义(P=0.834)；L+P组与L组比较差异有统计学意义(P<0.001),L+U组与L组比较差异有统计学意义(P<0.001),L+P组与L+U组比较差异有统计学意义(P<0.001)。IL-6检测值统计结果显示L组与C组比较差异有统计学意义(P<0.001),P组、U组与C组比较差异无统计学意义(P>0.425),P组与U组比较差异无统计学意义(P--0.742)；L+P组与L组比较差异有统计学意义(P<0.001),L+U组与L组比较差异有统计学意义(P<0.001),L+P组与L+U组比较差异有统计学意义(P<0.001)。TNF-a检测值统计结果显示L组与C组比较差异有统计学意义(P<0.001),P组、U组与C组比较差异无统计学意义(P>0.120),P组与U组比较差异无统计学意义(P=0.681)；L+P组与L组比较差异有统计学意义(P<0.001),L+U组与L组比较差异有统计学意义(P<0.001),L+P组与L+U组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：在离体细胞实验中,丙泊酚能够抑制内毒素刺激引起的IL-1p、IL-6、TNF-α等炎症因子释放,具有明显的抑制内毒素刺激引起的炎症反应作用,且其抑制作用较明显。第二章 丙泊酚对内毒素血症大鼠单个核细胞Annexin Al和p38磷酸化蛋白表达的影响目的：建立内毒素血症大鼠模型,用以进行动物实验,进一步观察丙泊酚抗炎作用的在体效应,并且进而观察丙泊酚对单个核细胞炎症相关蛋白质表达的影响。方法：将36只SD大鼠随机分为对照组(C组)、内毒素组(L组)、丙泊酚组(P组)、内毒素+丙泊酚组(L+P组)、乌司他丁组(U组)和内毒素组+乌司他丁组(L+U组),每组6只。建立内毒素血症大鼠模型后各组分别给予干预后收集大鼠血标本应用ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症细胞因子。将18只SD大鼠随机分为对照组(C1组)、内毒素组(L1组)、丙泊酚组(P1组)、内毒素+丙泊酚组(L1+P1组)、脂肪乳组(I组)和内毒素组+脂肪乳组(L+I组),每组3只。建立内毒素血症大鼠模型后各组分别给予干预后收集大鼠血标本应用Western blot技术检测单个核细胞Annexin A1和p38磷酸化蛋白水平。结果：IL-1p检测值统计结果显示L组与C组比较差异有统计学意义(P<0.001),P组、U组与C组比较差异无统计学意义(P>0.0.860),P组与U组比较差异无统计学意义(P=0.930)；L+P组与L组比较差异有统计学意义(P<0.001),L+U组与L组比较差异有统计学意义(P<0.001),L+P组与L+U组比较差异有统计学意义(P<0.001)。IL-6检测值统计结果显示L组与C组比较差异有统计学意义(P<0.001),P组、U组与C组比较差异无统计学意义(P>0.50),P组与U组比较差异无统计学意义(P=0.797)；L+P组与L组比较差异有统计学意义(P<0.001),L+U组与L组比较差异有统计学意义(P<0.001),L+P组与L+U组比较差异有统计学意义(P<0.001)。TNF-a检测值统计结果显示L组与C组比较差异有统计学意义(P<0.001),P组、U组与C组比较差异无统计学意义(P>0.75),P组与U组比较差异无统计学意义(P=0.915)；L+P组与L组比较差异有统计学意义(P<0.001),L+U组与L组比较差异有统计学意义(P<0.001),L+P组与L+U组比较差异有统计学意义(P<0.001)。Western blot检测,结果显示Annexin A1在LPS组表达量最低,而在对照组丙泊酚组表达量相当,而在LPS+丙泊酚组表达量显著增加。提示在内毒素刺激下,丙泊酚能促进炎症调控蛋白Annexin A1的表达。在内毒素大鼠血症中,我们发现丙泊酚可以明显增加Annexin A1,作为p38MAPK的内源性的抑制因子,Annexin A1表达量增加可能导致p38MAPK活性降低以及抑制炎性因子IL-1p、TNF-a和IL-6的产生,尽管我们在此实验中不能直接得出结论：丙泊酚对抑制p38MAPK的激活时通过Annexin A1表达的上调实现的,但是在LPS+丙泊酚组,内毒素血症大鼠单核细胞中,丙泊酚诱导的Annexin A1表达的上调一定在抑制p38MAPK的激活中起了关键的作用。结论：丙泊酚能够抑制内毒素血症大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的释放。丙泊酚这种抑制炎症反应作用的可能机制是它能够促进单个核细胞中AnnexinA1的表达,以及抑制p38的磷酸化,进而抑制炎症因子IL-1、IL-6、以及TNF-α的释放。第三章 丙泊酚对抑制THP-1细胞中Annexin A1后内毒素刺激下p38磷酸化表达的影响目的：采用体外RNAi技术,抑制Annexin A1在THP-1细胞中的表达,观察丙泊酚是否还能够抑制p38的磷酸化,从而验证丙泊酚抑制炎症反应的具体机制。方法：复苏THP-1细胞,加IPMI1640细胞培养基,15mM HEPES 10%胎牛血清,1OOU/ml青霉素,1OOμg/ml链霉素,传代2次,观察细胞形态与ACCA细胞库提供细胞形态相同,可以用于细胞实验。将Annexin A1 shRNA瞬时转染进THP-1细胞：我们从Gene Pharma RNAi公司定制合成了Annexin A1的shRNA,序列为5’-CCCUGGAUGAAACACUUAATT-3’; 5’-GCAGGAAUAUGUUCAAACUTT-3’; 5’-GCCUUGCAUAAGGCCAUAATT-3’.采用电穿孔的方法,将shRNA以及阴性对照转入THP-1细胞中。电穿孔条件为(1500V,20ms,2N)。放电后将细胞移入10%胎牛血清置细胞孵箱以37℃、5%C02条件培养24h。分别将细胞随机分为①野生型Annexin A1内毒素组(L组)、②野生型Annexin A1内毒素+丙泊酚组(L+P组)、③转染shRNA型Annexin A1内毒素组(L’组)、④转染shRNA型A nnexin A1内毒素+丙泊酚组(L’+P’组)。给予相应干预后,应用Western blot技术检测单个核细胞Annexin A1和p38磷酸化蛋白水平。结果：通过RNA干扰技术抑制了THP-1细胞Annexin A1表达以后,也就是给予丙泊酚干预后其促进THP-1细胞表达Annexin A1作用被阻断,此时在LPS刺激下的THP-1细胞p38磷酸化不再因丙泊酚的作用而受到抑制。结论：丙泊酚的抗炎作用是在其上调了Annexin A1表达,进而抑制p38磷酸化而完成的。也就是说Annexin A1是丙泊酚抗炎作用机制的重要分子信号。第四章丙泊酚对肝癌切除术患者炎症细胞因子的影响目的：对比观察丙泊酚与乌司他丁对围手术期患者炎症细胞因子的影响方法：选择诊断为原发性肝癌拟于全身麻醉下行肝癌切除术患者24例,采用完全随机数字法将24例患者随机分为3组(n=8)：空白对照组(C组),丙泊酚组(P组),乌司他丁组(U组)。干预措施为C组以0.5ml/kg/h速度持续静脉输注生理盐水至手术结束,P组以Marsh模型2.0mg/ml血浆靶浓度靶控输注丙泊酚至手术结束,U组静脉持续输注乌司他丁10000U/kg。采集各时点血清样本,ELISA法检测细胞因子。结果：IL-10检测结果分组与时间两因素交互效应不显著(F--1.539,P=0.222)；时间因素主效应差异有统计学意义(F=9.455,P<0.01),术前与其它各时点均有显著性差异(P<0.05)；分组因素主效应有统计学意义(F=4.017,P=0.033),P组与C组有显著性差异(P<0.05),U组与C组有显著性差异(P<0.05),在术毕时点,IL-10水平P组与C组比较差异有统计学意义(P=0.003)。IL-6检测结果分组与时间两因素交互效应不显著(F＝0.622,P=0.636)。时间因素主效应差异有统计学意义(F=27.544,P<0.001),各时间点均有显著性差异(P<0.05)；分组因素主效应差异不显著(F=0.166,P=0.848)。TNF-α检测结果分组与时间两因素交互效应显著(F-4.828,P=0.002)；术毕时点TNF-a水平组间有显著性差异(F＝30.187,P<0.001),P组与C组、P组与U组有显著性差异(P<0.05)；P组TNF-a水平各时点间有显著性差异(F＝5.947，P=0.004),术毕时点与其它三时间点均有显著性差异(P<0.05)。结论：镇静剂量的丙泊酚在临床上具有抗炎作用,其作用强度与乌司他丁10000U/kg剂量作用一致,具体效应有待进一步研究。