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脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是临床上常见的严重疾病之一,近年来发病率逐年增加。脊髓损伤一旦发生,其后发生的神经功能障碍就很难恢复,多数患者不得不长期卧床或依靠轮椅生活,给社会、家庭和患者本人带来了沉重的经济负担和心理负担。因此,如何重建脊髓神经结构的连续性及恢复脊髓神经功能成为全世界神经科学工作者研究的热点和正在努力解决的难题。近几年来随着现代医学,分子生物学和基因技术的发展,通过细胞移植治疗脊髓损伤已经成为当代医学研究的一个热门课题,特别是雪旺细胞对神经损伤的修复,引起人们越来越广泛的关注。雪旺细胞(Schwann cells,SCs)是周围神经系统的神经胶质细胞,在生理情况下对周围神经具有营养、支持、保护、绝缘功能;在中枢或外周神经损伤性疾病中SCs通过自身增殖、迁移、粘着、产生细胞外基质,参与周围神经的修复,也能分泌多种神经因子,促进神经元和神经胶质细胞存活、促进分裂增殖、抑制凋亡,对中枢神经系统的修复起重要作用。Neuregulin1(NRG1)是近年来发现的信号蛋白,主要由神经元和神经胶质细胞分泌,通过与受体酪氨酸激酶ErbB3和ErbB4细胞外结构区结合,导致ErbB同源或异源性二聚体形成,进而激活细胞内信号途径,使细胞发生生物学效应,包括刺激细胞的增殖、凋亡、迁移、分化和黏附等作用,可刺激神经元和神经胶质细胞增殖、抑制凋亡、促进损伤神经的修复与再生。鉴于雪旺细胞和NRG1在神经系统的独特生物学作用,本实验将NRG1基因与雪旺细胞移植载体相结合植入大鼠脊髓半离断模型,观察其在脊髓损伤治疗中作用并探讨其修复脊髓损伤的相关机制,为临床治疗脊髓损伤性疾病提供理论依据。本实验的主要研究内容和结果如下:一、雪旺细胞原代培养与纯化采用坐骨神经切断术,使神经体内预变性, 7天后取Wistar大鼠坐骨神经,通过织块移植,变换BS培养基中胎牛血清浓度,低酶消化双差速法,不加用任何促细胞分裂因子使成体雪旺细胞在短期内快速增殖,细胞密度达2.74×106/mm2;不用任何细胞分裂抑制剂可阻止成纤维细胞污染,使雪旺细胞纯度达96.1%。二、NRG1转染雪旺细胞及NRG1、ErbB2、ErbB4表达检测将pcDNA3.1-NRG1重组质粒通过Fugen6转染雪旺细胞(设对照组),转染组细胞出现明显分裂、增殖。用免疫荧光法检测细胞转染率为57.83%,采用免疫细胞化学法检测细胞中NRG1的表达。转染24h、48h、72h后分别收集各组细胞培养液上清,用ELISA检测NRG1表达,结果显示:对照组1.581±0.051 ng/ml,转染24h组1.537±0.110 ng/ml,转染48h组2.022±0.059 ng/ml,转染72h组2.250±0.165 ng/ml ,NRG1表达呈时间依赖性增加,48h、72h组与对照组比较差异显著(p <0.05);转染24h、48h、72h后分别收获各组细胞裂解,用ELISA分别检测NRG1和受体ErbB2、ErbB4在细胞中的表达,结果显示:NRG1表达呈时间依赖性增加,各组与对照组比较差异显著(p <0.05),72h组差异最为显著,ErbB2、ErbB4分泌呈时间依赖性增加,各组与对照组比较差异显著(p <0.05),72h组差异最为显著;这些结果提示:NRG1转染雪旺细胞后可促进细胞分裂增殖,同时可使细胞即时、稳定表达高水平的NRG1蛋白,并促使其特异性受体ErbB2、ErbB4表达上调。三、转基因雪旺细胞移植治疗大鼠脊髓损伤用旋切针制备大鼠脊髓半离断模型(Hemi-sectde Spinal Cord Injury,HSCI)术后经BBB(Basso,Beattie,Bresnahan locomotor rating scale)评分将入选动物随机分为三组,每组24只:A组为DMEM移植对照组、B组为雪旺细胞移植组、C组为转基因雪旺细胞移植组、正常对照组为D组;细胞移植后从第1周开始到第8周实验结束,每周对实验动物进行功能评价(BBB评分);细胞移植后每2周每组随机选取4只动物处死,取损伤段脊髓进行冰冻切片,观察回输细胞的存活状况,用免疫组化观察损伤段脊髓内神经元和少突胶质细胞形态和数量的变化,同时检测比较NRG1及其受体ErbB2、ErbB4在脊髓中的表达及分布变化;细胞移植后每4周每组随机选取4只动物进行MRI检测后处死,取损伤段脊髓固定后行TEM检测和HE染色,观察脊髓组织形态变化;4周后每组随机选取4只动物进行SEP检测,观察动物损伤侧肢体神经电生理恢复情况。结果显示:各组移植细胞均能在脊髓损伤区内存活,且转基因组细胞可分泌大量NRG1,促使其受体ErbB2、ErbB4表达上调,促进脊髓内少突胶质细胞增生;BBB、SEP、HE、TEM、MRI检测表明,各实验组脊髓损伤均有不同程度恢复,尤以转基因细胞组最为显著。通过以上研究得出以下结论:一、在体外将NRG1基因与雪旺细胞移植载体相结合,外源性NRG1基因可即时、稳定、高度表达,促使其特异性受体ErbB2、ErbB4表达上调。二、转基因细胞移植后可在脊髓损伤区内持续存活,不仅能分泌大量NRG1蛋白,促进脊髓损伤区内少突胶质细胞增殖,还可促使其特异性受体ErbB2、ErbB4在神经元和胶质细胞表达呈时间依赖性增加,保护受损神经元。三、将转染NRG1基因雪旺细胞原位植入大鼠脊髓半离断模型中,明显改善大鼠损伤侧后肢运动功能,有效促进神经功能的恢复,对脊髓损伤具有显著治疗作用,为临床治疗脊髓损伤性疾病开辟了一条新的途径。