肝脏移植目前已成为公认的治疗肝硬化、肝癌和肝衰竭等终末期肝脏疾病的最有效手段,也是治疗原发性肝癌的根治性方法。目前,肝移植患者的1年生存率大约为90%,而5年生存率为75%。据美国器官资源共享网络(UNOS)的统计,截止2014年8月8日,仅仅美国已有肝移植受者累积总数达到128894例。截至目前,我国已累计实施肝移植26600多例,已成为继美国后世界第二大肝移植大国。我国每年等待肝移植的患者已超过30万人,是世界上潜在肝移植需求者最多的国家。人体肠道内定植着数目庞大(1014)、结构复杂(超过1000种细菌)的微生物群落(约1.5公斤)。其细胞总量几乎是人体自身细胞数量的10倍,基因总量是人类自身基因的100倍,从营养、代谢、免疫等诸多方面影响人体健康。近10年来,肠道微生态在人体中的作用得到国际上前所未有的重视。肠道微生态与机体存在共生关系,是人体最为重要的微生态系统,是人体不可缺少的重要组成部分,相当于一个重要的代谢“器官”。肠道微生态是一个复杂的系统,包含2000多种微生物,在食物的消化吸收、维生素的合成、机体的免疫反应、代谢水平、抵抗致病菌定植等多个方面影响人体健康。肠道微生态与人体的健康和疾病密切相关,其作为新的药物靶点将是科学发展的趋势。肠道菌群和宿主共生并共进化过程中,在调节宿主的消化吸收、免疫反应、代谢等方面发挥重要作用。肠道微生态动态平衡的破坏可促进许多疾病的发生和发展,包括肝脏疾病。由于肝脏与肠道紧密的解剖与功能关系,肠道微生物在肠道中与宿主相互作用,通过肝-肠循环和微生态-肝脏轴,在肝脏炎症、损伤、慢性纤维化、肝硬化及肿瘤发生发展中发挥重要作用。肝脏炎症和疾病(包括酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝病和肝硬化等)往往伴随肠道渗透能力和微生态的改变；在疾病状态下,肠道微生态的紊乱可促进肝脏慢性炎症,导致肝脏大量慢性纤维化,进而促进肿瘤形成。在肝移植的手术过程中,移植肝和受者肠道不可避免的遭受缺血再灌注(Ischemia-reperfusion, I/R)损伤；而缺血损伤的肝脏和肠道很可能引起肠道微生态的失衡,进而破坏原有的稳定的肠道微生态与宿主的共生关系,加重移植肝损伤和失功能。同时,在肝移植中,移植物的I/R损伤和移植排斥损伤是移植物失功能的两大主要原因。“肝-肠轴”和“肝脏-微生态轴”紧密联系着肝脏功能和肠道功能,因而肝移植中移植肝损伤与肠道微生态变化紧密相关。在肝移植术后,移植受体前三个月的第一位直接死亡原因是感染,感染的病原菌大部分来源于肠道,主要包括细菌、真菌、病毒和寄生虫等,发生率为53%-79%,并且目前还没有很好的策略能够有效地控制肝移植术后的感染。因而,深入探讨肝移植后移植肝I/R损伤与肠道微生态变化的互作关系,以及肝移植后急性排斥损伤与肠道微生态变化的关系,对于肝移植术后改善移植肝功能、减轻移植排斥反应、降低肝移植术后感染率、减少肝移植后慢性移植肝失功能、提高肝移植患者长期存活和生活质量具有重大意义。在本研究中,我们围绕“移植肝损伤与肠道微生态相互作用”为主题,分为两部分进行详细阐述：(1)移植肝缺血再灌注损伤的改善促进肝移植后肠道微生态恢复的研究；(2)移植肝急性排斥损伤的发生发展与肝移植后肠道微生态变化的关系。第一部分移植肝缺血再灌注损伤的改善促进肝移植肠道微生态恢复研究目的：缺血再灌注损伤与肠道微生态失调紧密相关。在健康和疾病中,肝-肠轴紧密联系着肝脏功能和肠道功能。缺血预处理可以减轻外科手术中的缺血再灌注损伤。本研究旨在探讨供肝缺血预处理对肠道微生态的影响,并分析大鼠肝移植后肠道微生态结构转变的特征。研究方法：分别建立供肝和肠道缺血预处理的肝移植动物模型。检测移植肝病理和血清ALT/AST水平来反应移植肝的结构和功能；检测肠道粘膜超微结构、血清内毒素水平、细菌移位、粪便分泌型IgA含量和血清TNF-α水平来评估肠道屏障功能；实时定量PCR检测肠道优势菌群的变化；采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)来描述肠道微生态的组成和变化,并使用测序分析来鉴定差异的菌群。研究结果：肝脏缺血预处理可以改善肝移植后移植肝的功能,表现为：改善移植肝结构、降低血清ALT/AST水平。肝脏缺血预处理也改善肠道粘膜屏障的完整性,减弱肠道微绒毛的脱落和损伤,减轻肠道紧密连接的破坏。同时,血浆内毒素水平轻微下降,粪便上清sIgA含量明显升高,血浆TNF-α水平明显降低。RT-PCR对肠道优势菌群分析发现,肝移植早期存在明显的肠道微生态紊乱,表现为在细菌属的水平上,Bifidobacterium spp., Clostridium clusters Ⅺ和Clostridium cluster XIVab明显降低,而肝脏缺血预处理则促进其恢复。同时,基于肠道细菌的DGGE指纹图谱分析发现,肝移植早期移植物的I/R损伤造成肠道菌群多样性指数下降、物种丰度降低、物种均衡指数下降；而肝脏缺血预处理则提高了肠道菌群的多样性指数、物种丰度和均衡指数。DGGE聚类分析发现肝脏缺血预处理组和正常对照菌群结构明显聚集在一起,相似度为77.6%。通过细菌菌群的进化树鉴定了肝移植和肝脏缺血预处理后发生显著变化的关键菌群,发现肝脏缺血预处理后,10个关键菌株发生了明显变化,大部分属于拟杆菌门。研究结论：肝脏缺血预处理不仅能够改善移植肝功能和肠道屏障功能,也能够促进肝移植后肠道微生态的恢复,进而通过肠道微生态-肝脏轴的正反馈作用进一步促进移植肝功能的改善。第二部分移植肝急性排斥损伤的发生发展与肠道微生态变化的关系研究目的：急性排斥仍然是肝移植后威胁生命的并发症；临床上用于肝移植急性排斥的有效的诊断标志物很少。本研究旨在鉴定肝移植后急性排斥的肠道微生态特征,并探讨肠道微生态作为急性排斥的生物标志物的应用价值。研究方法：建立大鼠原位肝移植后急性排斥反应发生发展的动物模型。动态观察急性排斥发生发展过程中移植肝病理、超微结构、移植肝功能和肠道屏障功能。动态收集大鼠回盲部内容物进行肠道微生态分析。研究结果：在肝移植后急性排斥组,移植肝在移植后1天经受了肝脏I/R损伤,移植后3天开始出现急性排斥损伤,而移植后7天则表现为重度急性排斥损伤。肠道菌群定量PCR显示,在急性排斥期间,在细菌属的水平上,Faecalibacterium prausnitzii和Lactobacillus菌属比例降低,而Clostridium bolteae比例明显升高。重要的是,DGGE聚类分析显示急性排斥第3天和第7天的菌群结构明显聚类在一起,相似度为73.4%,这表明在肝移植急性排斥过程中,肠道微生态的变化早于肝脏病理和肝功能的改变。同时,在急性排斥期间,肠道菌群多样性和物种丰度均明显降低。进化树显示,在急性排斥期间,大部分减少的关键菌属于厚壁菌门,而增加的关键菌属于拟杆菌门。在急性排斥期间,肠道微绒毛丧失,紧密连接破坏；肠道屏障功能破坏主要表现为粪便sIgA含量下降,血中细菌培养阳性率、内毒素和TNF-α升高。研究结论：我们动态描述了肝移植后急性排斥反应发生发展过程中肠道微生态的变化特征,发现在肝移植急性排斥反应期间,肠道微生态的变化早于肝脏病理和肝功能的改变,这表明肠道微生态变化可用来预测肝移植后早期急性排斥反应,也可成为肝移植后改善急性排斥损伤的辅助性靶标。