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玉米(Zea mays L.)是重要的粮食、饲料作物,但玉米籽粒蛋白质缺乏必须氨基酸,尤其缺乏赖氨酸和色氨酸,从而限制了其营养价值。Opaque-2突变基因(o2)可以显著提高籽粒赖氨酸和色氨酸含量,利用o2突变体是优质蛋白玉米(QPM)育种的主要途径。由于我国QPM种质基础狭窄,限制了QPM在我国的发展。迄今,许多学者已对QPM的遗传学及生物学基础开展了较多的研究,初步阐明了o2基因的功能和相关生物学基础,但这些理论仍不能满足QPM育种的需要。因此,本研究利用分子标记辅助选择技术把o2基因导入到不同遗传背景的普通玉米自交系,扩增我国QPM种质的基础。主要对分子标记辅助选择方法和o2基因在不同遗传背景下的功能进行研究,同时还对赖氨酸含量与籽粒性状进行了通径分析。主要研究内容、方法和结果如下:
1、本研究选用CA335、CA339、鲁2548和齐205等四个国内QPM自交系为o2基因供体,对o2基因的编码序列分析表明,四个自交系属于两类o2等位基因,CA335和CA339属于一类,鲁2548和齐205另一类。两类o2等位基因作为o2基因供体,利用phi057标记选择效果差异较大,CA335和CA339为供体,77份普通玉米为受体构建成功了45份o2近等基因系(NILs);而以齐205和鲁2548为供体,11份普通玉米为受体未能成功构建o2NILs。
2、Phi057、umc1066和phi112三个o2特异性SSR标记中,phi057在普通玉米和QPM自交系间的多态性最好。利用AFLP和SSR标记对14份o2 NIL与其轮回亲本的遗传相似性及o2基因所在的7.01区段的供体片段的分析结果表明,利用phi057辅助选择,回交各代只须种植20株左右的群体,且无需利用分子标记进行遗传背景选择,回交5代左右即可获得遗传相似性较高(95％左右)的o2NILs。但是,o2 NILs在o2基因附近仍包含部分供体亲本的染色体片段。
3、比较分析了14份o2近等基因系与轮回亲本的籽粒性状、胚乳醇溶蛋白(Zein)的积累和籽粒超微结构的差异。结果表明,o2基因除可以提高籽粒赖氨酸含量和油分含量、降低籽粒硬度和密度外,还具有增大胚(p=0.001)、提高胚比(p=0.0002)和降低淀粉含量(p＜0001)等功能,但是粗蛋白含量(p=0.0566)和胚乳重差异不显著(p=0.3564)。醇溶蛋白的SDS-PAGE分析表明,所有o2 NILs材料的醇溶蛋白合成均发生了变化,19-kD和22-kDα-zein合成显著降低,22-kDα-zein的合成受到强烈抑制,27kDγ-zein的合成基本没有变化。扫描电镜对籽粒超微结构的观察显示,与普通玉米比,o2NILs的淀粉粒多为圆形,淀粉粒排列疏松,淀粉粒表面没有基质蛋白包裹,或仅有少量的基质蛋白;电镜观察还发现,普通马齿型玉米的粉质部分与不透明的o2突变体也有差异,区别在于普通玉米的粉质部分仍有较多的基质蛋白。赖氨酸含量的高低可能与籽粒类型没有直接的联系,而主要受醇溶蛋白量的影响。
4、通过分子标记选择技术把o2基因导入到不同遗传背景的普通玉米自交系中,发现一些o2 NILs的赖氨酸含量和其它籽粒性状均存在一定的可变性。值得注意的是,本研究发现两个o2 NILs(丹598o2和辽2345o2)的籽粒赖氨酸含量没有提高。SDS-PAGE的分析表明o2基因对这两个自交系的醇溶蛋白合成影响较小,两个o2 NILs与其它赖氨酸含量提高的o2 NILs F1赖氨酸含量的分析结果表明,可能存在着未知因素对籽粒赖氨酸含量起重要作用。这种o2玉米既不同于高赖氨酸玉米也不同于QPM,为了和普通玉米区别建议称之为o2非高赖氨酸玉米,新发现有利于研究和完善o2基因的功能。
5、利用28份自交系对籽粒赖氨酸含量和籽粒性状的相关和通径分析表明,油分、胚重和胚比与赖氨酸含量呈显著的正相关,淀粉含量、密度、胚乳重和胚乳硬度量呈显著的负相关,百粒重和粗蛋白含量与赖氨酸含量相关不显著。各籽粒性状对赖氨酸含量的直接影响力大小依次为胚比＞胚重＞胚乳重＞胚乳硬度等级＞密度＞油分＞淀粉含量＞百粒重＞粗蛋白含量。其中,胚重对籽粒赖氨酸含量有最大的直接负向效应,胚比对赖氨酸含量起关键作用。