三角帆蚌CaM和Ets基因的克隆及镧对其表达的影响

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhaojian1990
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钙调蛋白(Calmodulin,CaM)是一种广泛存在于动植物细胞内的Ca2+受体蛋白,调节多种酶的活性,并参与介导生命活动进程的炎症反应、代谢、细胞凋亡、肌肉收缩、细胞内运动、神经生长以及免疫应答等活动,还在增强抗肿瘤、抗精神病、大脑记忆等方面有临床应用,表现出了良好的医学应用前景,因此对钙调蛋白调节机制的研究愈加广泛而深入,但目前对贝类钙调蛋白及其功能的研究所知甚少。为了探讨三角帆蚌钙调蛋白(hcCaM)介导的Ca2+信号通路的机制,本研究克隆并鉴定了hcCaM基因和三角帆蚌转录因子(erythroblastosis-twenty six,Ets)(hcEts)基因;并且探讨了镧离子(Lanthanum,La3+,与Ca2+离子空间结构十分相似)对hcCaM和hcEts基因表达及CaM下游蛋白碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)活性的影响。结果如下:1、hcCaM基因片段长562bp,含有一个完整的450bp开放阅读框,编码一个149个氨基酸的蛋白,具有CaM蛋白的特征性结构—4个EF-hands结构域,hcCaM与其它无脊椎动物和脊椎动物具有很高的同源性(95.3%-96.6%);此外,系统进化树同样证明它在无脊椎动物和脊椎动物中均十分保守。hcEts片段长777 bp,包含一个完整的阅读框,编码一个含258个氨基酸的蛋白,并具有Ets家族蛋白的特征性结构—ETS结构域。hcEts基因是首次在无脊椎动物淡水珍珠蚌(三角帆蚌)中克隆并鉴定出的Ets转录因子基因。hcEts与其它动物的的同源性为27.91%-87.1%,与瓜蟾和家鸡最低,为27.91%;与栉孔扇贝最高,为87.1%;此外,系统进化分析表明hcEts和栉孔扇贝Ets基因遗传地位相似。2、La3+对hcCaM基因表达影响的研究结果:LaCl3处理后24、72和168 h,hcCaM的表达极显著提高(P<0.01);LaCl3+三氟拉嗪(Trifluoperazine,TFP,一种钙调蛋白特异性抑制剂)处理组和TFP处理组中,整个试验过程中hcCaM基因的表达与对照组比较没有显著差异。结果表明La3+可以诱导hcCaM基因的转录,从而提高hcCaM基因的表达,但是TFP可抑制La3+的这种作用。3、La3+对hcEts基因表达影响的研究结果:LaCl3处理组中,LaCl3处理6 h后hcEts基因的表达相对对照组(0h)极显著降低(P<0.01),处理24 h后hcEts的表达极显著提高(P<0.01),但在处理3、12和48 h后hcEts基因的表达没有显著性差异,其结果与LaCl3处理后hcCaM基因的表达结果相似,表明La3+可能通过Ca2+/CaM信号通路提高hcEts基因的表达;而在TFP处理组中,处理3、6和12 h后hcEts基因的表达相对对照组(0h)极显著降低(P<0.01),表明Ca2+/CaM信号通路被TFP阻断后,显著降低了hcEts基因表达;处理24和48h后hcEts基因的表达相对对照组没有显著性差异,暗示降低的hcEts基因表达激活了其它的信号通路,TFP+LaCl3处理组的结果进一步暗示可能存在其它调控hcEts基因表达的Ca2+介导的信号通路。4、La3+对AKP活性影响的研究结果:在LaCl3+TFP处理12 h时,AKP活性与对照组(0 h)比较显著提高(P<0.05),但在处理24、72和168 h时,AKP活性与对照组比较没有显著差异,结果表明hcCaM还可以通过竞争性的结合La3+调节AKP的活性。
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