研究背景和目的近年来,随着人们生活方式及饮食结构的改变,结直肠癌的发病率及致死率呈逐年上升的趋势。目前,临床上结直肠癌的治疗是以手术治疗为主,以放化疗为辅,但疗效有限。在世界范围内结直肠癌位居恶性肿瘤的第三位,其中转移和复发是导致结直肠癌患者死亡的重要原因。因此探讨结直肠癌转移的分子标记物有利于将早期筛查结直肠癌患者,协助临床早期诊断,早期治疗;有利于为结直肠癌患者提供新的治疗靶点,进一步提高结直肠癌的治疗效果。miRNA是位于真核生物中的一种长约20-25bp非编码蛋白的小分子RNA。研究显示,在乳腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌等肿瘤中均发现miRNA异常表达,且在肿瘤的发生、发展过程中起着至关重要作用。miRNA主要是通过抑制下游靶mRNA翻译而发挥类似癌基因或抑癌基因的作用,它包括两种途径:1、miRNA与靶基因mRNA的3’UTR以完全互补的方式结合,指导沉默复合体降解靶基因mRNA;2、miRNA与靶基因mRNA的3’UTR以不完全互补的方式结合,抑制靶基因mRNA的转录后翻译。研究表明miRNA通过两种方式参与调控肿瘤的发生、发展:1、肿瘤细胞中miRNA异常表达,miRNA抑制下游靶基因的表达,影响一系列的信号通路,最终改变肿瘤细胞自身的生物学特性,如增殖、侵袭、转移能力等;2、异常表达miRNA的肿瘤细胞通过多种方式如囊泡等将miRNA或蛋白分泌到细胞外,这些外分泌物质被肿瘤微环境中的间质细胞摄取或者与间质细胞表面的配体相结合,促使间质细胞的生物学行为发生改变,如:血管增生能力、内皮细胞连接等,最终影响肿瘤的发展。miR-25位于7号染色体上,它既是miR-106b-25簇的成员之一,又是MCM7基因内的miRNA。研究表明:卵巢癌中miR-25发挥抑制凋亡的作用;食管鳞状细胞癌中miR-25能促进肿瘤细胞侵袭能力;胃癌、结直肠癌中miR-25有促进肿瘤细胞增殖的能力。另外,结直肠癌、肝细胞癌研究显示mir-106b-25簇在肿瘤基质中的表达量比正常基质中表达量高,且miR-106b-25簇与内皮细胞有紧密联系。在鼠肺支气管干细胞研究提示miR-25可能与肿瘤细胞的自我更新能力相关。前期miRNA芯片筛查结果提示miR-25可能作为结直肠癌转移相关潜在靶点,在本课题中,我们主要探究miR-25在结直肠癌侵袭、转移及微环境中的作用机制。旨在揭示一个新的miR-25的调控机制,为临床抗结直肠癌侵袭、转移提供新的miRNA和基因靶点。研究方法1.miR-25在结直肠癌组织中的表达及其对结直肠癌细胞株体内外生物学特性的影响(1)利用实时荧光定量PCR验证miR-25在60对结直肠癌组织表达情况并对其进行临床病理分析;原位杂交方法检测miR-25在30例结直肠癌组织样本中定位;qRT-PCR的方法检测6株结直肠癌细胞中miR-25的内源性表达;(2)利用阳离子脂质体法,将miR-25 inhibitor或miR-25 mimics瞬时转染至结直肠癌细胞株中,应用实时荧光定量PCR检测miR-25表达水平改变;(3)使用过表达miR-25慢病毒感染结直肠癌细胞株以构建稳定表达miR-25的细胞株,应用实时荧光定量PCR检测miR-25表达水平改变;(4)利用CCK8法、平板克隆形成实验、体外迁移实验、细胞凋亡实验,检测干扰或过表达miR-25对体外结直肠癌细胞株增殖、迁移、凋亡能力的影响;(5)应用干细胞成球试验、干性标记物基因表达,检测干扰或过表达miR-25对体外结直肠癌细胞株干细胞特性的影响;(6)应用肿瘤细胞诱导内皮细胞迁移实验和肿瘤细胞条件培养基诱导内皮细胞迁移实验,检测干扰或过表达miR-25对内皮细胞生物学行为的影响;(7)采用裸鼠皮下成瘤模型,检测过表达miR-25后对裸鼠皮下成瘤能力的影响;(8)利用鼠尾静脉注射肺定植模型,检测过表达miR-25后对裸鼠尾静脉注射后肺定植能力的影响。2.预测并鉴定miR-25的下游靶基因(1)采用生物信息学网站 miRBase、TargetScan、Pictar、DIANA-microT、及RNAhybrid预测miR-25的下游靶基因,通过取多个软件预测结果的交集及预测评分较高的靶基因,选择KLF4、FBXW7作为研究对象。应用双荧光素酶报告实验验证miR-25与靶基因的3’UTR直接结合。(2)应用实时荧光定量PCR和Western Blot验证miR-25与靶基因之间的调控关系,检测干扰或过表达miR-25后,靶基因KLF4、FBXW7的表达水平改变。(3)利用实时荧光定量PCR检测6株结直肠癌细胞及12对结直肠癌组织中miR-25的表达水平,用Western Blot检测6株结直肠癌细胞及12对结直肠癌组织中KLF4、FBXW7的表达水平,Pearson或Spearmen方法分析miR-25与KLF4、miR-25与FBXW7之间的表达相关性。3.miR-25通过下游靶基因参与结直肠癌的侵袭、转移及撖环境的调控(1)应用阳离子脂质体法,将miR-25 mimics和KLF4或FBXW7编码区表达载体共转染至结直肠癌细胞株中,利用Western Blot检测KLF4、FBXW7表达水平的改变;(2)利用CCK8法、平板克隆形成、体外迁移实验,检测过表达miR-25及共表达miR-25和FBXW7对体外结直肠癌细胞增殖、迁移能力的影响;(3)利用体外迁移实验,检测过表达miR-25及共表达miR-25和KLF4后肿瘤细胞诱导脐静脉内皮细胞的迁移能力;(4)利用体外迁移实验,检测肿瘤细胞过表达miR-25及共表达miR-25和KLF4后肿瘤细胞条件培养基诱导脐静脉内皮细胞的迁移能力。4.统计学分析使用SPSS 13.0统计学软件对数据进行分析,定量数据由3次独立实验的结果汇总,均用均数±标准误表示。两组间数据的比较使用独立样本T检验,多组间数据的比较使用One-way ANOVA。细胞株及组织中miR-25和FBXW7,miR-25和KLF4表达水平的相关性,正态分布资料使用Pearson’s相关系数,非正态分布资料使用Spearman’s相关系数。p<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1.miR-25在结直肠癌组织中表达上调与结直肠癌肿瘤大小、分化程度、浸润深度和转移相关(1)miR-25在结直肠癌组织中表达上调,且与转移相关基因芯片共筛选出115个转移相关miRNAs,其中42个miRNAs在淋巴结转移组及远处转移组表达水平明显上调。结直肠癌组织中miR-25的表达水平较正常肠粘膜组织高,而在淋巴结转移组和远处转移组miR-25表达水平进一步上调。实时荧光定量PCR检测结果显示:60对结直肠癌组织miR-25的表达水平显著高于配对的正常肠粘膜组织(t=6.686,p<0.01)。临床病理分析结果显示,miR-25在60对结直肠癌组织中的表达水平与结直肠癌肿瘤大小、分化程度、浸润深度和转移显著相关(t=-2.259,p=0.028;F=21.72,p<0.001;F=5.35,p=0.007;F=4.728,p=0.013),而与患者的年龄、性别无显著关系(t=-1.001,p=0.321;t=0.893,p=0.375)。(2)miR-25结直肠癌组织中定位原位杂交检测结果表明在30例结直肠癌组织样本中,25例组织样本miR-25在肿瘤细胞中表达明显高于相应的正常肠上皮细胞。间质细胞中,miR-25在内皮细胞的表达较高,提示miR-25在结直肠组织样本中的上皮细胞及内皮细胞均有表达。(3)miR-25在结直肠癌细胞中内源性表达实时荧光定量PCR检测miR-25在6株结直肠癌细胞中的表达,以结直肠癌细胞株SW620为对照,HT29表达量最高,其次依次为SW480、HCT116、LS174t、Lovo。单因素方差分析显示,miR-25在6种细胞株间的表达具有显著差异。两两比较显示miR-25在HT29细胞中的表达显著高于SW480、HCT116、Ls174t、Lovo、SW620细胞中的表达,且差异具有显著性。2.miR-25促进结直肠癌细胞体外增殖、迁移能力,裸鼠体内成瘤及肺定植能力(1)干扰或过表达miR-25后效率验证与Blank组、NC组相比,在HT29和SW48细胞瞬时转染miR-25 inhibitor后 miR-25 表达水平明显下降(F=230.421,p<0.01;F=36.500,p<0.01),与 Blank组、NC组相比,在SW620和SW480细胞中瞬时转染miR-25 mimics后miR-25表达水平显著升高(F=429.974,p<0.01;F=1163.997,p<0.01)。以空载体病毒(mock)为对照,在SW620、SW480细胞中感染miR-25慢病毒后 miR-25 的表达明显上调(t=10.292,p=0.009;t=15.857,p<0.01)。(2)miR-25促进结直肠癌细胞体外增殖与NC组相比,干扰miR-25抑制HT29、SW480细胞的增殖能力(P=433.037,p<0.01;F=1306.266,p<0.01),抑制肿瘤细胞从 G1 期进入 S 期(G1 期:t=-23.409,p<0.001;t=-9.240,p=0.001;S 期:t=7.543,p=0.002;t=3.365,p=0.028;G2期:t=5.120,p=0.007;t=9.803,p=0.001)。Western Blot 的检测结果显示:与NC组相比,干扰miR-25后周期相关蛋白CyclinD3、CyclinD1、CDK4、CDK6的表达下调。与mock组相比,稳定表达miR-25促进SW620、SW480细胞的增殖能力(t=435.972,p<0.01;t=521.112,p<0.01)、平板克隆形成能力(t=10.276,p=0.001;t=10.315,p<0.01),促进肿瘤细胞从 G1 向 S 期演进(G1 期:t=19.328,p<0.001;t=12.082,p<0.001;S 期:t=-4.421,p=0.012;t=4.293,p=0.013;G2 期:t=-14.005,p<0.007;t=16.208,p<0.001)。Western Blot 的检测结果显示:与 mock 组相比,稳定表达miR-25后周期相关蛋白CyclinD3、CyclinD1、CDK4、CDK6的表达升高。(3)miR-25与结直肠癌细胞体外凋亡无关凋亡实验的检测结果表:与NC组相比,干扰miR-25对SW480细胞的凋亡明显的影响(t=0.164,p=0.878);SW620/mock与SW62/miR-25之间凋亡细胞的百分率无显著性差异(t=-0.284,p=0.791)。(4)miR-25促进结直肠癌细胞体外迁移Transwell迁移实验表明:与Blank组、NC组相比,干扰miR-25抑制HT29、SW480 细胞的迁移能力(F=100.479,p<0.01;F=94.444,p<0.01);与 mock 组相比,稳定过表达miR-25促进SW620、SW480细胞的迁移能力(t=433.037,p<0.01;t=1306.266,p<0.01)。(5)miR-25促进结直肠癌细胞获得干细胞性特性在SW620、SW480细胞稳定表达miR-25后,第二代干细胞球的形成能力增强(t=-13.258,p<0.01;t=-5.578,p=0.005)。干性标记物 SOX2、OCT4、ALDH1 mRNA表达水平的检测正在进行。(6)稳定表达miR-25的肿瘤细胞促进脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移Transwell迁移实验表明:与NC组相比,干扰miR-25的HT29、SW480细胞诱导脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移能力明显下降(t=7.256,p<0.01;t=10.061,p<0.01);稳定表达miR-25的SW620、SW480细胞诱导脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移能力显著增强(t=-11.165,p<0.001;t=-10.205,p<0.001)。(7)稳定表达miR-25的肿瘤细胞的条件培养基(TCM)促进脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移Transwell迁移实验表明:与NC组相比,在HT29、SW480细胞中干扰miR-25后,其条件培养基诱导脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移能力明显下降(t=10.735,p<0.01;t=6.242,p<0.01);在 SW620、SW480 细胞稳定表达 miR-25 后,其条件培养基诱导脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移能力显著增强(t=9.495,p<0.001;t=10.914,p<0.01)。(8)miR-25促进结直肠癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力裸鼠皮下成瘤的实验结果显示:与SW620/mock组相比,SW620/miR-25组皮下肿瘤的重量显著增加(t=-3.526;p=0.008);(9)miR-25促进结直肠癌细胞的裸鼠尾静脉注射肺定植能力裸鼠尾静脉注射肺转移实验结果表明:与SW620/mock组相比,SW620/miR-25组形成的肺转移结节数量明显升高(t=3.241;p=0.012)。3、FBXW7、KLF4 是 miR-25 的靶基因(1)使用 miRDB、TargetScan、microRNA.org、Pictar 和 DIANA-microT 生物信息学软件预测miR-25的靶基因,发现细胞骨架相关基因TACC2、EXOC5、MYO1B,细胞侵袭转移相关基因FBXW7和血管相关基因KLF2、KLF4均可能为miR-25的靶基因。(2)成功构建包含与miR-25预测结合位点的TACC2、EXOC5、SOCS5、MYO1B、FBXW7、KLF2、KLF4的Wt3’UTR双荧光素酶报告载体,将阴性对照NC或miR-25与靶基因Wt3’UTR和共转染至HEK293A、SW480细胞,在miR-25 存在的情况下,MYO1B、KLF2、KLF4、FBXW7 的 Wt3’UTR 荧光素酶活性显著下调(MYO1B:F=51.312,p<0.01;F=28.276,p=0.001;KLF2:F=19.624,p=0.002;F=36.597,p<0.01;KLF4:F=11.169,p=0.009;F=18.676,p=0.003;FBXW7:F=15.213,p=0.004;F=19.817,p=0.002)。在 Blank 组、NC组和miR-25组之间TACC2、EXOC5、SOCS5的Wt 3’UTR荧光素酶活性无显著性差异(TACC2:F=1.276,p=0.345;F=4.955,p=0.054;EXOC5:F=4.566,p=0.062;F=1.195,p=0.366;SOCS5:F=2.253,p=0.186;F=0.848,p=0.474)。(3)Western Blot检测结直肠癌细胞中干扰或过表达miR-25后FBXW7、KLF4的蛋白表达水平。与Blank组、NC组相比,干扰miR-25使HT29、SW480细胞FBXW7、KLF4的表达上调;与mock组相比,稳定表达miR-25使SW620、SW480细胞FBXW7、KLF4蛋白表达水平下降。(4)Western Blot检测FBXW7、KLF4在6株结直肠癌细胞和12对配对结直肠癌组织中蛋白表达水平。在6株结直肠癌细胞株中,FBXW7的蛋白表达与miR-25的表达呈负相关关系(r=-0.814,p=0.049);在6株结直肠癌细胞中,KLF4的蛋白表达与miR-25的表达无明显相关性(p>0.05),而在4株结直肠癌细胞中,两者存在负相关关系(r=-1.000,p<0.001);在12对配对结直肠癌组织中,FBXW7的蛋白表达与miR-25的表达呈负相关关系(r=-0.909,p<0.001);在6对结直肠癌组织中,KLF4的蛋白表达与miR-25的表达呈负相关关系(r=-0.899,p=0.014)。4.miR-25通过下游靶基因参与结直肠癌的侵袭、转移及微环境的调控(1)成功构建包含KLF4、FBXW7的过表达质粒(不含其3’UTR),分别转染至SW620、SW480细胞中,Western Blot检测结果表明:过表达质粒能使相应的蛋白在SW620、SW480细胞中表达上调。(2)miR-25通过下调FBXW7而抑制结直肠癌细胞体外迁移能力在 SW620、SW480 细胞中,mock 组、miR-25 组和 miR-25/FBXW7 组之间细胞迁移能力具有显著性差异(F=63.586,p<0.01;F=28.376,p<0.01)。与mock组相比,miR-25组细胞迁移能力显著增强(p<0.01;p<0.01),在miR-25组的细胞表达FBXW7后,细胞的迁移能力明显减弱(p<0.01;p<0.01)。后续试验正在进行。结论1.miR-25在结直肠癌组织中表达上调与结直肠癌肿瘤大小、分化程度、浸润深度和转移相关,初步明确:在结直肠癌组织中miR-25发挥着促癌的作用;2.miR-25促进结直肠癌细胞体外增殖、迁移能力,裸鼠体内成瘤及肺定植能力。miR-25促进结直肠癌细胞诱导内皮细胞的迁移。3.MYO1B、FBXW7、KLF2、KLF4 是 miR-25 的靶基因;4.miR-25通过抑制FBXW7的表达而促进结直肠癌细胞的迁移能力。