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酸敏感离子通道（acid-sensing ion channels,ASICs）是一类细胞外质子门控的阳离子通道,在中枢神经系统主要分布ASIC1a。突触传递过程中,囊泡中的酸性物质伴随递质一起释放到突触间隙,导致局部质子浓度瞬间增加,通过激活突触后膜ASIC1a传递酸信号,从而参与突触可塑性、学习记忆以及条件性恐惧记忆等。在一些病理条件下,正常的酸碱平衡被破坏,导致质子逐步累积,产生组织酸化,过度激活ASIC1a引起神经损伤。组织酸化是多种神经系统疾病（如缺血性中风、癫痫、多发性硬化症以及亨廷顿舞蹈症等）的共同病理特征,针对ASIC1a及其信号通路进行干预可以为酸毒相关的疾病提供新的治疗策略。已有研究证实在小鼠大脑中动脉梗塞模型（middle cerebral artery occlusion,MCAO）中,敲除Asic1a显著减小缺血梗死体积。普遍认为ASIC1a通透的离子信号引起胞内钙超载介导了神经损伤。我们研究发现ASIC1a的非通道功能在缺血性神经元程序性坏死（necroptosis）中发挥重要作用。酸化诱导受体相互作用蛋白1（serine/threonine kinase receptor interaction protein 1,RIP1）结合到ASIC1a C末端,导致RIP1磷酸化和神经元程序性坏死。进一步研究发现ASIC1a N末端能够对抗C末端的毒性,形成分子内抑制（intramolecular inhibition）。本课题主要围绕ASIC1a的非通道功能,从离体和动物模型两个层面,采用药物干预和基因操控的手段论证ASIC1a的非通道功能介导缺血后神经元程序性坏死,并靶向ASIC1a的非通道功能开发新的神经保护剂,揭示缺血后酸毒的新机制,并为其治疗提供新的靶点和策略。首先,通过筛选已知的死亡通路抑制剂,我们发现RIP1磷酸化的特异性抑制剂Nec-1显著抑制酸化诱导的神经元死亡,提示RIP1在酸化诱导的神经损伤中至关重要。进一步体外实验发现酸化激活ASIC1a通道诱导神经元坏死不依赖其通道功能,而是通过ASIC1a C末端与RIP1的结合引起后者的磷酸化,从而激活下游死亡信号通路。模拟ASIC1a C末端的跨膜肽TAT-CP-1在p H 7.4的条件下就能诱导RIP1的磷酸化和细胞死亡。在MCAO小鼠的缺血侧脑组织中检测到ASIC1a-RIP1的结合以及RIP1磷酸化水平的增高;Asic1a敲除后,缺血不引起RIP1磷酸化增多和神经元程序性坏死。这些证据表明ASIC1a介导的缺血性神经元死亡是一种依赖其C末端的程序性坏死。接下来,酸化调控ASIC1a C末端的分子机制是本课题研究重点。荧光能量共振转移实验显示在生理情况下ASIC1a N末端与C末端紧密结合;当细胞接受酸刺激时,ASIC1a N末端和C末端解离。在CHO上转染N末端缺失的ASIC1a,直接导致细胞死亡,提示N末端在C末端的功能调控中起重要作用,两者形成分子内抑制。为了深入了解酸化时N末端和C末端解离的机制,我们利用蛋白质谱技术寻找缺血前后与ASIC1a结合改变的蛋白,发现在缺血脑组织中N-乙基马莱酰胺敏感性融合蛋白（N-ethylmaleimide-sensitive fusion ATPase,NSF）与ASIC1a结合显著增加,免疫共沉淀实验显示缺血诱导形成特异性NSF-ASIC1a-RIP1复合体。敲除Asic1a基因,或者给予ASIC1a抑制剂Pc TX1阻断NSF-RIP1的结合。药物和基因水平抑制NSF不影响ASIC1a的通道功能,却能抑制ASIC1a的非通道功能,从而抑制酸毒损伤。进一步研究发现NSF结合于ASIC1a N末端前20个氨基酸序列(NT1-20)。人工合成的跨膜肽TAT-NT1-20抑制NSF-ASIC1a-RIP1复合体的形成和RIP1的磷酸化,在细胞和动物水平减轻ASIC1a介导的酸毒损伤。以上结果证实酸化促进NSF与ASIC1a N末端结合,促进ASIC1a分子内抑制的解除,从而启动ASIC1a介导的酸毒损伤。为了进一步验证ASIC1a介导的程序性坏死与通道功能无关,我们利用CRISPR/Cas9技术构建ASIC1a通道功能缺失的转基因鼠,将Asic1a基因孔道位置的三个关键氨基酸32HIF34突变成AAA,使其通透离子的功能丧失。研究发现HIF突变小鼠MCAO后脑梗死体积与野生型无统计学差异,证明ASIC1a的通道功能不是缺血损伤模型中ASIC1a介导神经元死亡的主要原因。在HIF突变小鼠的MCAO模型上,缺血侧也同样检测到NSF-ASIC1a-RIP1复合体和RIP1的磷酸化;Nec-1和Pc TX1在其中也具有神经保护的作用,这说明ASIC1a的非通道功能不依赖其离子通透功能。该研究观察了ASIC1a的非通道功能在缺血性神经损伤中的作用,并进一步研究了神经元程序性坏死的分子机制,鉴定了一类以ASIC1a代谢通路为靶点的神经保护多肽。这一系列研究不仅揭示了ASIC1a在信号传导过程以及神经损伤中的分子机制,也为治疗酸化相关的疾病提供了新的思路。