背景与目的：　　缺血性脑卒中是严重危害人类生命健康的常见疾病。脑卒中患者中枢神经系统（central nervous system; CNS）损伤后神经修复困难;治疗效果有限;大多数患者遗留有不同程度的神经功能障碍;给家庭和社会造成了极大的负担。因此;急需寻找促进缺血脑卒中后神经修复的新靶点。　　卒中后轴突再生受限是神经修复困难的重要原因;脑卒中后主要由反应性增生的星形胶质细胞形成的胶质瘢痕则是轴突再生受限的关键因素之一。缺血性脑卒中后;星形胶质细胞发生以高表达胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein; GFAP）与细胞肥大为特征的反应性增生并迁移至损伤区域边缘;成为损伤区域边缘形成的胶质瘢痕的主要成分。胶质瘢痕抑制轴突再生的原因主要有两个方面：一是反应性增生的星形胶质细胞相互缠绕形成了一层物理屏障抑制轴突再生;二是反应性增生的星形胶质细胞合成并分泌轴突再生抑制分子硫酸软骨素多聚蛋白糖（chondroitin sulfate proteoglycans; CSPGs）至细胞外基质;形成了抑制轴突再生的化学屏障。卒中后抑制反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成促进神经功能的恢复。因此;深入研究缺血性脑卒中后反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成的机制并寻找治疗靶点;有助于损伤神经的修复;促进神经功能恢复;具有重要的临床意义。然而;目前对于卒中后反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成的分子机制并不清楚。　　排斥性导向分子a（repulsive guidance molecule a; RGMa）是排斥性导向分子（repulsive guidance molecule; RGM）家族的一员;是一种通过糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol; GPI）锚定于细胞膜的蛋白;参与CNS众多生理、病理环节;是值得深入研究的蛋白分子。本课题组既往研究发现RGMa在大鼠大脑中动脉阻塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion; MCAO/R）后的缺血脑组织中高表达;采用腺病毒等干预手段抑制RGMa 表达可促进轴突再生及神经功能恢复。然而;RGMa 是否是通过调控卒中后反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成从而发挥轴突再生抑制作用则尚不清楚。　　目前研究发现;缺血性脑卒中后;转化生长因子β1（transforming growth factor β1; TGFβ1）表达迅速上调;TGFβ1通过活化其I型受体活化素受体样激酶 5（activin receptor-like kinase 5; ALK5）磷酸化Smad2/3;促进星形胶质细胞反应性增生及胶质瘢痕形成。同时;TGFβ1亦可使星形胶质细胞RGMa表达上调。因此;我们推测缺血性脑卒中后;RGMa通过TGFβ1/Smad2/3通路促进星形胶质细胞反应性增生及胶质瘢痕形成;从而抑制神经功能的恢复。　　本研究拟首先建立在体大鼠 MCAO/R 模型;采用 RGMa 抑制剂6FNIII和腺病毒rAd-shRGMa干预;明确RGMa对大鼠MCAO/R后反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成的作用;随后;体外培养大鼠原代星形胶质细胞;应用TGFβ1、ALK5抑制剂SB431542、rAd-shRGMa干预;阐明RGMa调控反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成的机制。　　第一部分 RGMa对大鼠MCAO/R后反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成的作用　　目的：　　明确RGMa对大鼠MCAO/R后反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成的作用。　　方法：　　1. 成年雄性 Sprague–Dawley（SD）大鼠建立 MCAO/R 模型; Western blot检测缺血后7 d、14 d缺血侧脑组织RGMa表达;免疫荧光共染RGMa与GFAP。　　2. 成年雄性SD大鼠侧脑室注射rAd-HK（2.5×1010 pfu/ml）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline; PBS）、不同浓度的6FNIII（低浓度;0.25 mg/ml;中浓度;0.5 mg/ml;高浓度;1.0 mg/ml）或不同滴度的rAd-shRGMa（低滴度;0.625×1010 pfu/ml;中滴度;1.25×1010 pfu/ml;高滴度;2.5×1010 pfu/ml）并建立MCAO/R模型;采用Western blot检测塌陷反应介导蛋白-2 （ collapsing response mediator protein-2; CRMP-2）表达和行为学staircase实验评估6FNIII最适给药浓度;采用激光共聚焦显微镜检测 rAd-shRGMa 携带的增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein; EGFP）表达和Western blot检测RGMa蛋白表达评估腺病毒最佳感染滴度。　　3. 成年雄性SD大鼠采用6FNIII、rAd-shRGMa干预RGMa表达和功能;建立MCAO/R模型;MCAO/R后14 d免疫荧光检测缺血侧脑组织GFAP表达;观察星形胶质细胞形态变化;MCAO/R后7 d、14 d Western blot检测缺血侧脑组织GFAP表达。　　4. 动物模型的构建及干预同上;MCAO/R后7 d、14 d免疫荧光检测缺血区域CSPGs家族的neurocan和phosphacan表达。　　5. 动物模型的构建及干预同上;MCAO/R建模前2 d;建模后7 d、10 d、14 d利用staircase实验和cylinder实验评估大鼠神经功能。　　结果：　　1. 与正常组相比;MCAO/R后7 d、14 d缺血侧脑组织RGMa表达明显升高（p<0.01）;MCAO/R后7 d、14 d RGMa在胶质瘢痕中反应性增生的星形胶质细胞中高表达。　　2. 中浓度（0.5 mg/ml）与高浓度（1.0 mg/ml）6FNIII组的大鼠缺血侧脑组织CRMP-2表达及staircase实验得分较MCAO/R、PBS对照组明显增高（p<0.01）;且同样显著高于低浓度组（0.25 mg/ml）（p<0.05）;中浓度组与高浓度组之间CRMP-2表达及staircase实验得分无明显差异（p>0.05）。6FNIII的最适浓度为0.5 mg/ml。　　3. 激光共聚焦显微镜检测显示三种滴度（低滴度; 0.625×1010 pfu/ml;中滴度; 1.25×1010 pfu/ml;高滴度; 2.5×1010 pfu/ml ）的rAd-shRGMa和rAd-HK（2.5×1010 pfu/ml）均成功感染大鼠缺血侧脑组织;与低滴度、中滴度相比;高滴度最能有效抑制RGMa表达（p<0.05）。rAd-shRGMa的最适滴度为2.5×1010 pfu/ml。　　4. 免疫荧光结果显示;与 MCAO/R 组相比; 6FNIII 组和rAd-shRGMa组星形胶质细胞肥大程度较轻、相互缠绕较少;GFAP表达也显著减少（p<0.01）。Western blot结果与此类似;与MCAO/R组、PBS组、rAd-HK组相比;6FNIII 组和 rAd-shRGMa 组大鼠MCAO/R后7 d、14 d GFAP表达明显降低（p<0.01）。　　5. MCAO/R 后 7 d 和 14 d;与 MCAO/R 组相比;6FNIII 组和rAd-shRGMa组neurocan和phosphacan表达显著降低（p<0.01）。　　6. MCAO/R后大鼠staircase实验得分下降（p<0.01）;cylinder实验asymmetry score升高（p<0.01）;而6FNIII或rAd-shRGMa干预明显抑制了 MCAO/R 引起的 staircase 实验得分降低（ p < 0.05 ）和asymmetry score升高（p<0.01）。　　结论：　　大鼠MCAO/R后RGMa在胶质瘢痕反应性增生的星形胶质细胞中高表达;6FNIII和rAd-shRGMa抑制了MCAO/R后反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成;促进神经功能的恢复;提示缺血性脑卒中后星形胶质细胞中表达的RGMa促进星形胶质细胞反应性增生及胶质瘢痕形成;从而抑制神经功能的恢复。RGMa 有可能成为缺血性脑卒中治疗的新靶点。　　第二部分RGMa调控反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成的机制　　目的：　　探讨 RGMa 调控反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成的机制。　　方法：　　1. 体外培养新生 SD 大鼠原代星形胶质细胞;应用不同浓度的TGFβ1（1、5、10、25、50、100 ng/ml）培养3 d;Western blot检测RGMa蛋白表达。　　2. 体外培养新生SD大鼠原代星形胶质细胞;分别给予TGFβ1（10 ng/ml; 3 d）、TGFβ1+SB431542、TGFβ1+DMSO处理;Western blot检测RGMa蛋白表达;免疫荧光共染RGMa与GFAP。　　3. 体外培养新生 SD 大鼠原代星形胶质细胞; rAd-shRGMa 或rAd-HK感染星形胶质细胞;荧光显微镜观察EGFP表达;Western blot检测RGMa表达。　　4. 体外培养新生 SD 大鼠原代星形胶质细胞; rAd-shRGMa 或rAd-HK感染细胞后TGFβ1 10 ng/ml培养3 d;免疫荧光GFAP标记星形胶质细胞观察细胞形态;Western blot检测GFAP表达;transwell小室检测细胞迁移;CCK-8（Cell Counting KIT-8）检测细胞增殖;Western blot检测细胞条件培养基中neurocan、phosphacan表达。　　5. 体外培养新生SD大鼠原代星形胶质细胞;干预同上;Western blot检测Smad2和Smad3表达与磷酸化。　　6. 体外培养新生 SD 大鼠原代星形胶质细胞;干预同上;分别用anti-ALK5 抗体和 anti-RGMa 抗体进行免疫共沉淀;检测 ALK5、Smad2/3、RGMa之间的相互作用。　　结果：　　1. Western blot结果显示;1-100 ng/ml浓度的TGFβ1培养3 d后;星形胶质细胞RGMa表达均显著升高（p<0.01）;免疫荧光结果显示; 10 ng/ml TGFβ1培养星形胶质细胞3 d可以诱导星形胶质细胞RGMa、GFAP 表达增多及细胞肥大。Western blot 还发现;与 TGFβ1 组和TGFβ1+DMSO组相比;TGFβ1+SB431542组RGMa表达明显降低（p<0.01）;免疫荧光结果显示;与TGFβ1+DMSO组相比;TGFβ1+SB431542组RGMa和GFAP表达较少、细胞肥大程度较轻。　　2. 荧光显微镜检测EGFP表达显示;rAd-shRGMa和rAd-HK均成功感染星形胶质细胞;Western blot结果发现;感染rAd-shRGMa的星形胶质细胞RGMa表达显著降低（p<0.01）。　　3. 与 TGFβ1 组和 TGFβ1+rAd-HK 组相比;rAd-shRGMa 抑制了TGFβ1 诱导的星形胶质细胞肥大、GFAP高表达、迁移及 neurocan和phosphacan的分泌（p < 0.01）;rAd-shRGMa和TGFβ1均对星形胶质细胞增殖无明显影响（p>0.05）。　　4. TGFβ1+rAd-shRGMa 组 p-Smad2、p-Smad3 较 TGFβ1 组、TGFβ1+rAd-HK 组显著降低（p < 0.01）;Control 组、TGFβ1 组、TGFβ1+rAd-shRGMa组、TGFβ1+rAd-HK组Smad2、Smad3表达无明显差异（p>0.05）。　　5. rAd-shRGMa感染体外培养的原代星形胶质细胞没有影响ALK5表达;rAd-shRGMa感染使TGFβ1诱导的ALK5-Smad2/3结合减少;anti-RGMa 抗体免疫共沉淀下来的蛋白复合物中可以检测到 Smad2/3和ALK5;且蛋白复合物中Smad2/3和ALK5量的变化与细胞中RGMa蛋白表达的变化趋势是一致的。　　结论：　　TGFβ1通过ALK5促进RGMa在星形胶质细胞中的表达;RGMa通过与ALK5和Smad2/3直接或间接结合促进ALK5磷酸化Smad2/3; RGMa通过介导TGFβ1诱导的Smad2/3磷酸化调控反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成。