肿瘤的三大传统治疗手段，手术、放疗和化疗，已有百年的历史，但由于创伤大、副反应大、疗效低等临床问题，使其临床应用受到限制。因此，寻找损伤小且能有效控制肿瘤生长和转移的治疗方法，成为临床肿瘤治疗的迫切需求。随着肿瘤学、免疫学以及分子生物学等相关学科的迅速发展和交叉渗透，各种形式的肿瘤免疫治疗方法正逐渐由试验走向临床应用，而过继性免疫治疗是目前较为常用的一种肿瘤免疫治疗方法，成为现代肿瘤治疗的第四大手段。　　 过继性免疫治疗是将经处理的自体或异体的免疫细胞或免疫分子输给患者，以增强患者细胞免疫功能的一种行之有效的肿瘤治疗方法。但是在大量的动物和临床试验中发现，抗肿瘤效应细胞虽然在体外具有较好的杀伤功能，但是回输体内后，在肿瘤微环境中通常被诱导进入“免疫无能”状态，因此不能有效地识别和杀伤肿瘤细胞，出现效应细胞与肿瘤细胞共存的尴尬局面。因此，消除体内的免疫抑制微环境，充分发挥效应细胞的功能，对于提高肿瘤免疫治疗疗效非常重要。　　 目前认为肿瘤免疫逃逸的相关机制可能包括肿瘤抗原隐匿或调变、肿瘤细胞MHC-Ⅰ类分子表达下降、细胞因子的负性调节、Fas/FasL作用、黏附分子/共刺激分子缺陷和抑制性免疫细胞亚群作用等。肿瘤细胞能自发分泌免疫抑制性因子，如TGF-β、IL-10、血管内皮生长因子等，可抑制T细胞的分化，促进Th1-Th2平衡向Th2漂移，并下调T细胞黏附或/和共刺激分子的表达，诱导对肿瘤特异性CTL的耐受。另外，荷瘤状态下可诱导多种具有负向免疫调节功能的抑制性免疫细胞亚群在肿瘤局部的扩增和聚集。这些细胞可强烈抑制具有抗肿瘤活性的免疫效应细胞，特别是T细胞，从而在肿瘤的免疫逃逸中发挥重要作用。抑制性细胞亚群包括调节性T细胞（regulatoryT cells，Treg），肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages，TAM)和髓系来源的抑制性细胞(myeloid-derivedsuppressorcens，MDSC)等。因此，研究如何有效下调肿瘤微环境中的免疫抑制性因子和抑制性细胞，打破肿瘤免疫逃逸，提高抗肿瘤免疫效应细胞的活性，延长其体内存留时间，提高其杀伤效率对于提高肿瘤的免疫治疗疗效具有十分重要意义。　　 本课题从四个方面进行了研究:　　 1.体外成功制备黑色素瘤抗原特异性CTL并检测其体外免疫杀伤效应;进一步利用荧光染料2-羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)进行CTL染色标记，通过CCK-8测定CFSE对CTL增殖的影响，检测对比CTL和CFSE-CTL对黑色素瘤肿瘤细胞的体外杀伤作用，建立一种筛选CFSE对CTL最佳染色条件的有效方法;　　 2.通过成功建立C57BL/6黑色素瘤小鼠动物模型，利用低剂量环磷酰胺（cyclophosphamide，CYC）腹腔注入对荷瘤小鼠体内微环境进行有效干预，明确CYC干扰后Treg、IL-10、TGF-β三者降低的关系和具体时间;　　 3.利用CFSE标记成熟DC提呈的肿瘤抗原特异性CTL过继回输荷瘤小鼠体内，探讨低剂量CYC对CTL效应细胞分布和迁移、瘤体内存留时间及其功能状态的影响和作用;　　 4.探讨CYC干扰肿瘤微环境后，肿瘤组织中INF-γ、IL-2、Perfoin和Granzyme的表达变化以及外周血中IL-2和IFN-γ的浓度变化情况，明确CYC应用对打破肿瘤免疫耐受，提高抗原特异性CTL体内免疫杀伤效率的具体机制。　　 第一部分、抗原特异性CTL对恶性黑色素瘤细胞体外免疫杀伤效应和CFSE对CTL最佳染色条件的确立　　 目的：通过体外制备黑色素瘤抗原特异性CTL，探讨CTL对肿瘤细胞的体外免疫杀伤效应;通过CCK-8测定CFSE标记对CTL增殖的影响，对比分析CTL和CFSE-CTL对黑色素瘤细胞的体外杀伤效应，确定CFSE标记CTL的最佳条件，并建立一种CTL体内示踪的有效方法。　　 方法：对小鼠骨髓来源DC细胞进行提取与培养，形态学观察、表型和功能鉴定，同时制备B16肿瘤抗原并负载于DC;利用免疫磁珠阴性分离纯化小鼠脾脏CD3+T细胞，并和负载肿瘤抗原的成熟DC混合培养以制备B16细胞抗原特异性CTL。留取激活的T细胞72h后产生的各组CTL上清液，检测对比各上清液中IFN-γ和IL-2的平均浓度。采取不同的CFSE染色浓度(2.5μM、5μM、10μM)对抗原特异性CTL进行荧光标记，利用CCK-8测定不同CFSE染色浓度对CTL增殖的影响，筛选最佳染色浓度。进一步以筛选的最佳染色浓度对CTL进行染色后，将CTL和CFSE-CTL分别同B16细胞混合共孵育(E∶T=20∶1)，观察对比CTL和CFSE-CTLL对B16肿瘤细胞杀伤特征和杀伤率，分别测定其上清液中IFN-γ和IL-2平均浓度，比较各组间差异。　　 结果：小鼠骨髓来源DC细胞培养至第7天，相差显微镜下观察发现有大量具有典型毛刺状形态的成熟DC细胞悬浮在上清液中聚集成团;流式细胞学检测细胞表面MHC-Ⅱ和CD86、CD11c和CD86的表达水平，分别为90.9％和94.2％，均呈高表达。免疫磁珠阴性分离纯化CD3+T细胞，流式细胞检测鉴定CD3+T细胞纯度达91.3％;加入已负载肿瘤抗原的成熟DC混合培养3-4天后，倒置显微镜下观察可见在DC集落的附近又出现了很多小的T细胞集落，CTL活化扩增。激活T细胞72h后产生的各组CTL上清液，空白对照组、T细胞组和DC+T细胞组比较IFN-γ和IL-2浓度均有显著性差异（P＜0.05）。利用CFSE对CTL效应细胞进行荧光标记，染色率几乎达100％;CCK-8测定不同浓度CFSE染色对CTL增殖的影响，显示5μM浓度染色效果好，且对细胞毒性最小，为最适宜的染色浓度。CTL和CFSE-CTL对B16肿瘤细胞体外杀伤作用的对比分析，两组CTL杀伤率无显著性差异(P＞0.05)，杀伤特征亦无明显差别;两组上清液中IFN-γ和IL-2平均浓度亦均无显著性差异(P＞0.05)。因此，适宜的CFSE染色标记对CTL的增殖和活性不会产生影响。　　 结论：抗原特异性CTL在体外对恶性黑色素瘤细胞具有免疫杀伤效应;利用适宜的CFSE浓度对CTL染色标记，同样具有较好的杀伤效应，而CCK-8试验可以作为筛选CFSE对CTL最佳染色条件的有效方法。　　 第二部分、低剂量环磷酰胺腹腔注入对C57BL/6黑色素瘤小鼠体内肿瘤微环境的干预研究　　 目的：通过成功建立C57BL/6黑色素瘤小鼠动物模型，探讨低剂量环磷酰胺腹腔注入对荷瘤小鼠体内微环境的干预作用，明确CYC干扰后荷瘤小鼠体内Treg、IL-10、TGF-β三者变化的关系和具体时间。　　 方法：取对数生长期的黑色素瘤细胞悬液(5×105/ml)0.2ml皮下接种于小鼠侧背部颈后区域，建立荷瘤小鼠模型。荷瘤小鼠随机分为两组，荷瘤小鼠CYC腹腔注入组(CYCI)和荷瘤小鼠NS腹腔注入组(NSI)，每组30只。在建模成功后，分别按照分组情况对CYCI组小鼠按照20mg/kg进行腹腔注入，同时对NSI组小鼠腹腔注入等量生理盐水作为对照。流式检测注射前、注射后1，4，7，11和15天小鼠脾脏CD4+CD25+foxp3+Tcells(Tregs)水平变化，ELISA法检测血清中IL-10、TGF-β水平变化;观察各组肿瘤生长情况，判定低剂量CYC注射对肿瘤生长影响。　　 结果：于C57BL/6小鼠侧背部皮下接种B16细胞后7天左右，皮下可触及直径约5毫米左右质硬黑色结节，界限清楚，较固定，视为建模成功。分析两组各时间点Tregs水平和血清中TGF-β、IL-10含量，结果显示:NSI组小鼠脾脏Tregs水平和血清IL-10、TGF-β含量随着瘤体增长而逐渐增高;而CYCI组小鼠脾脏Tregs和血清IL-10水平于CYC注射后第4天显著降低，以后则缓慢有所提升，而血清TGF-β水平则推迟至CYC注射后第7天降低至最低水平。两组相比，Tregs/CD4+T cells(P＜0.05)、IL-10(P＜0.05)和TGF-β(P＜0.05)均有显著性差异。低剂量CYC应用后，两组荷瘤小鼠肿瘤体积不存在显著性差异(P＞0.05)。　　 结论：利用低剂量CYC腹腔注入对荷瘤小鼠体内微环境进行有效干预，在降低Treg水平的同时，也降低了血清中IL-10、TGF-β含量;低剂量CYC虽然缓解了机体的免疫抑制，但对肿瘤生长无明显的抑制作用。　　 第三部分、通过干扰肿瘤微环境延长抗原特异性CTL瘤体内效应时间和改善其分布模式的实验研究　　 目的：探讨CFSE荧光标记对肿瘤抗原特异性CTL的体内示踪价值，明确小剂量CYC应用对改善CTL效应细胞体内有效分布和延长其瘤体内存留效应时间，打破免疫耐受的重要作用。　　 方法：制备B16细胞抗原特异性CTL后，采用5μM CFSE染色浓度对抗原特异性CTL效应细胞进行荧光标记并培养。于d0天造模，将造模成功之荷瘤小鼠分为两组，荷瘤小鼠NS腹腔注入+CFSE-CTL回输组(NSI+CTL)40只;荷瘤小鼠CYC腹腔注入+CFSE-CTL回输组(CYCI+CTL)40只，共80只。d7天造模成功即给予每只荷瘤小鼠腹腔注入CYC(20mg/kg)或等量NS;在注射后第4天，分别给两组小鼠回输培养的CFSE-CTL，5×106个/0.2ml/只。将以上每组小鼠再随机按照回输后不同时间点(6h、1d、3d、6d、10d、15d、21d)分为7组，每组5只。分别于CFSE-CTL回输后不同时间点处死小鼠，并取外周血100μl。称取19重不同时间肿瘤、肝、脾、肺、脑、肾组织酒精固定，剪碎研磨，裂解红细胞，制备单分散细胞悬液。加于Ficoll-Paque淋巴细胞分离液，离心后取淋巴细胞液层，流式细胞仪对CFSE标记淋巴细胞荧光强度进行检测。CFSE-CTL在组织中的聚集情况以％FI/g表示（每克组织中CFSE-CTL荧光强度），T/NT值（肿瘤组织中％FI/g/非肿瘤组织中％FI/g）反映回输CTL在各组织中的存留、分布和肿瘤归巢情况。分别取两组回输后不同时间肿瘤组织制备15μm厚冰冻切片，利用激光共聚焦显微镜观测两组肿瘤组织内CFSE阳性细胞大致分布情况。同时对不同时间点肿瘤组织中CFSE-CTL细胞周期进行对比分析。　　 结果：肿瘤组织中％FI/g在CYCI+CTL组比NSI+CTL组明显增高和持久(P＜0.05);两组间各时间点G0/G1、S和G2/M各期细胞比例无显著性差异(P＞0.05)。CTL在体内各脏器分布随时间而变化，回输早期，两组CTL均显示富集于肿瘤组织中，所有组织T/NT＞1，冰冻切片显示两组肿瘤组织中较高的荧光强度;从第3天至第15天，两组之间CTL分布模式出现差异:CYCI+CTL组肿瘤组织表现为持续而较高的荧光强度，所有组织中T/NT＞1;而在NSI+CTL组肿瘤组织则表现为短暂而较低弱的荧光强度，大多数组织中T/NT＜1;最后第21天，NSI+CTL组所有组织中荧光强度均显示明显降低（所有组织T/NT＜1），而肿瘤组织中％FI/g几乎接近背景对照水平，低于其他组织分布。CTL在肝、肾、脾和肺中分布丰富，荧光强度较高，T/NT值较低;而在脑和外周血中始终保持较低而稳定的分布水平，荧光强度较低，T/NT值较高。比较两组各组织中％FI/g，在肿瘤(P＜0.05)、肝（P＜0.05）和脾脏(P＜0.05)组织中存在显著性差异。而在肺(P＞0.05)、脑(P＞0.05)、肾(P＞0.05)和外周血（P＞0.05）中不存在显著性差异。　　 结论：利用CFSE对CTL进行荧光标记体内示踪，观察直观、标记率高，示踪时间长且性质稳定，无放射性污染;低剂量CYC提前干预肿瘤微环境后，CTL在肿瘤组织中的归巢聚集和持续效应时间都明显增强，分布模式得以改善。　　 第四部分、通过干扰肿瘤微环境提高抗原特异性CTL对肿瘤体内免疫杀伤效率的实验研究　　 目的：通过检测低剂量CYC应用后荷瘤小鼠外周血中IL-2和IFN-γ浓度和肿瘤组织中INF-γ、IL-2、Perfoin和Granzyme表达，以及肿瘤生长情况，探讨干扰肿瘤微环境对抗原特异性CTL杀伤效率和对肿瘤生长影响。　　 方法：制备B16细胞抗原特异性CTL，同时建立C57BL/6黑色素瘤小鼠模型，于d0天造模，d7天造模成功后，效应细胞注射前，将95只荷瘤小鼠分为五组，具体如下:荷瘤小鼠NS腹腔注入组(NSI，n=5);荷瘤小鼠CYC腹腔注入组(CYCI，n=5);荷瘤小鼠NS腹腔注入+CTL输注组(NSI+CTL，n=40);荷瘤小鼠CYC腹腔注入+CTL输注组(CYCI+CTL，n=40);单纯荷瘤小鼠组（Control，n=5只）。CYCI组和CYCI+CTL组每只荷瘤小鼠CYC腹腔注入（20mg/kg），NSI组和NSI+CTL组腹腔注入等量生理盐水，Control组不实施任何治疗。在腹腔注射CYC和NS后第4天即d11天，分别自NSI+CTL组和CYCI+CTL组小鼠鼠尾静脉回输以上培养的CTL效应细胞，5×106个/0.2ml/只。将以上CYCI+CTL组和NSI+CTL组小鼠按照回输后6h、1d、3d、6d、10d、15d、21d不同时间点分别将每组小鼠摘取眼球取血100μl置入无菌EP管中，离心吸取上清，ELISA法检测对比CTL回输后两组外周血中IL-2和IFN-γ浓度。同时分别切取两组1cm3左右肿瘤组织，用RT-PCR方法检测不同组间肿瘤组织中目的基因INF-γ、IL-2、颗粒酶（Granzyme）、穿孔素（Perfofin）mRNA转录水平的变化情况。各组计算肿瘤体积并进行对比，绘制肿瘤生长曲线。　　 结果：采用秩和检验分析显示，CTL回输后两组外周血中IL-2(P＜0.05)和IFN-γ(P＜0.05)浓度均存在显著性差异，CYCI+CTL组高于NSI+CTL组。RT-PCR检测CTL回输后两组肿瘤组织中INF-γmRNA、IL-2mRNA、PerfoinmRNA和GranzymemRNA表达，按照2-△△ct相对定量计算出各样品目的基因相对含量，采用秩和检验进行比较，结果显示:两组肿瘤组织中Perf(P＜0.05),GrzB(P＜0.05),IL-2(P＜0.05)和IFN-γ(P＜0.05)表达均存在显著性差异，CYCI+CTL组明显高于NSI+CTL组，且自CTL回输后第3-15天这种差距尤为显著。观察肿瘤生长情况，采用重复测量方差分析，结果显示:免疫治疗的早期，各组间肿瘤体积不存在显著性差异（P＞0.05）;在回输后第3天，对照组和CYCI+CTL组(P＜0.05)，NSI组和CYCI+CTL组(P＜0.05)，CYCI组和CYCI+CTL组(P＜0.05)间存在显著性差异。在以后的较长时期内（从第6天直到第21天），除了对照组、NSI组和CYCI组外(P＞0.05)，各组间均存在显著性差异(P＜0.001)。NSI+CTL组和CYCI+CTL组间的肿瘤抑制效果自CTL回输后第6天到第15天尤为显著。　　 结论：低剂量CYC应用干扰肿瘤微环境后，肿瘤组织中INF-γ、IL-2、Perfoin和Granzyme表达升高，同时外周血中IL-2和IFN-γ浓度也相应升高，肿瘤生长受到抑制，提示CTL活性增强，杀伤效率提高。　　 基于以上四部分的研究可以得出以下结论:利用CFSE进行CTL染色标记，通过CCK-8测定CFSE标记对CTL增殖影响和检测染色后CTL对肿瘤细胞的杀伤作用，可以筛选CFSE对CTL染色的最佳条件;提前低剂量CYC应用，可对荷瘤小鼠体内微环境进行有效干预，在降低Treg水平同时，也降低血清中IL-10、TGF-β含量，并且使CTL在肿瘤组织中的归巢聚集和存留效应时间都明显增强，CTL对肿瘤的杀伤效率得以提高，肿瘤生长受到抑制。