研究背景乙型脑炎的病原体称为乙型脑炎病毒,在国际上称为日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）。JEV引起的脑炎在国际上称为日本脑炎（Japanese encephalitis,JE）,在我国称为流行性乙型脑炎（Epidemic encephalitis B,简称乙脑）,是我国法定的乙类传染病,也是目前亚洲病毒性脑炎的首要原因。其感染人体后主要引起以高热、惊厥、抽搐、意识障碍等为表现的病毒性脑炎综合征。由于缺乏特异性的治疗方法,因而具有较高的致死率与致残率。JEV的嗜神经性是其致病的关键所在,病毒感染神经元后在细胞内大量增殖,一方面直接引起细胞的损伤与死亡,另一方面病毒活化的小胶质细胞和外周浸润的免疫细胞可引起免疫病理损伤,两者造成神经元大量死亡和过度炎症反应是导致患者致死及神经系统后遗症的重要机制。病毒是严格的细胞内寄生生物体,其完成生命周期所需的能量及复制原料均依赖于宿主细胞所提供的营养物质及生物大分子。因此,病毒进化出多种策略以调控宿主细胞代谢状态而利于其复制。多数病毒感染后一般将促进细胞葡萄糖的摄取及糖酵解过程,促进脂肪酸与核苷酸的合成从而维持其高消耗的复制增殖过程,但不同病毒在调控代谢重编程中往往具有各自的特异性,同一病毒在感染不同细胞类型所呈现的代谢重编程也不尽相同。目前,尚无系统的JEV感染与宿主细胞在代谢层面相互作用的研究。因此,明确JEV感染神经元及脑炎发生过程中脑内代谢特征及调控机制,对于研究JEV致病机制及寻找新的靶向代谢的治疗策略均有重要意义。研究目的本研究以JEV感染神经元及JEV攻毒小鼠模型为主要研究对象,旨在明晰JEV感染后引起的宿主细胞代谢重编程及脑炎发生发展过程中的代谢特征,探索JEV感染与宿主细胞在代谢层面的相互作用并揭示其相关机制,为病毒致病机制奠定理论基础,并以代谢为治疗靶点进行初步干预,为JEV感染提供潜在的治疗靶点及新的诊疗思路。方法与结果本研究基于JEV感染神经元细胞系、原代神经元及小鼠模型,通过代谢组学与转录组学整合分析,初步明确了 JEV感染Neuro2a细胞系所呈现的代谢重编程特征及小鼠JE发生发展过程中脑内代谢状态,并基于此以代谢通路为靶点进行初步干预,探索JEV感染致脑炎的临床治疗新策略。1.JEV感染导致神经元细胞系代谢重编程及其相关调控机制JEV的嗜神经性是其致脑炎的关键所在。为明确JEV感染与神经元在代谢层面的相互作用,我们采用代谢组学-转录组学关联分析,初步发现了 JEV感染神经元细胞系Neuro2a的早期（24 h内）细胞内代谢重编程明显,主要是葡萄糖利用的增加及糖酵解活性的增强,氨基酸及脂类物质分解代谢增强,这些代谢特征均是细胞为了适应病毒复制早期所需要的大量能量和合成原料。此外,代谢组学-转录组学调控网络分析表明在JEV感染后脂类物质的代谢重编程较为显著,佐证了脂代谢在黄病毒生命周期中的关键作用。为揭示病毒感染引起的宿主细胞代谢重编程的相关机制,我们结合JEV感染神经元后呈现的代谢特征及转录组学KEGG通路分析,利用Western Blot实验分析代谢调控的上游分子变化,结果显示JEV感染早期（24 h内）会促进AMPK的磷酸化水平从而参与代谢重编程的调控过程,随着感染时间的增加其水平逐渐降低。进而通过对JEV结构与非结构蛋白编码基因的过表达实验,表明JEV病毒颗粒及多种相关蛋白,尤其是非结构蛋白NS1显著参与了 AMPK信号通路的激活。这些结果提示:JEV病毒感染神经元的早期AMPK信号通路活性的增加诱导细胞呈现出包括糖酵解活性的增强,脂肪酸的分解消耗等分解代谢的特征,维持了 JEV大量复制增殖过程中所需的能量物质及合成原料。2.靶向糖代谢重编程可有效抑制JEV复制基于JEV感染引起的糖酵解途径活性的增强,及AMPK信号通路作为细胞内能量代谢感受器在JEV感染引起神经元糖代谢重编程中起着关键作用,我们进一步研究了糖代谢如何调控JEV复制。首先通过对JEV感染Neuro2a及原代神经元进行葡萄糖的剥夺实验,结果表明JEV的有效复制显著依赖于葡萄糖。继而我们对葡萄糖的关键代谢途径糖酵解途径进行外源干预,明确了糖酵解过程对于维持JEV复制增殖的重要性。进而通过对糖酵解分支磷酸戊糖途径进行干预,结果显示宿主细胞核苷酸合成原料的缺乏将直接影响病毒基因组的复制过程。以上结果表明宿主细胞葡萄糖代谢,包糖酵解途径及磷酸戊糖途径,对于JEV的有效复制均不可或缺。氨基酸代谢与糖代谢密不可分,尤其是谷氨酰胺（Glutamine,Gln）,作为连接葡萄糖代谢、氨基酸代谢及核苷酸代谢的关键中间物质,其代谢是否影响JEV的复制。我们通过对JEV感染Neuro2a及原代神经元进行谷氨酰胺剥夺实验,发现其剥夺后反而促进了 JEV在神经元内的增殖。与此同时,外源性添加Gln进入三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle,TCA cycle）的中间物质 α-酮戊二酸（2-oxoglutarate,AKG）同样可以显著抑制JEV的复制。进一步利用siRNA技术低表达细胞中Gln生成AKG的关键酶谷氨酸脱氢酶及AKG在TCA循环中利用的关键酶α-酮戊二酸脱氢酶,结果显示通过抑制Gln生成AKG或抑制AKG在TCA循环中的利用,均可有效的促进JEV复制,提示Gln-谷氨酸（Glutamate,Glu）-AKG轴在抑制JEV复制中起到了关键的作用。这可能与JEV复制时需要上调糖酵解而同时抑制氧化磷酸化过程有关,尚需进一步深入分析。3.小鼠JE发生后不同病程脑内代谢重编程及其干预的初步研究尽管神经元是JEV感染最重要的靶细胞,但在JE发生发展过程中,病毒在神经元中的复制增殖往往是脑内炎症发生的始动因素,而随着神经元的大量坏死及小胶质细胞的过度活化,脑内产生的剧烈的炎症风暴才是导致JE死亡及产生神经系统后遗症的重要原因。因此,从在体层面研究JE发生发展过程中脑内代谢重编程,明晰JE发生后病毒与脑内多种细胞类型相互作用导致的复杂的代谢特征变化,对揭示JEV致脑炎机制及寻找可能的干预靶点十分重要。为此,我们通过足底注射JEV的方式构建了小鼠脑炎模型,在其出现神经症状时,即JEV入脑后分不同阶段进行脑组织的代谢组学检测,证实了在JE发生后,氨基酸代谢、脂类物质代谢及嘌呤嘧啶代谢发生显著变化。在JE发生的早期,脑内合成代谢增强,多数代谢物质包括氨基酸、脂类等水平均在不同程度有所增加。而在JE的终末期,小鼠脑内大量代谢物与早期相比呈现降低趋势。其原因可能为在JE早期,脑内代谢由于病毒大量的复制增殖与免疫应答的激活促使其合成代谢增加。而随着脑炎的进展,大量神经元发生坏死,小胶质细胞过度活化,致使脑内合成代谢无法代偿从而出现降低。而用于维持细胞氧化还原平衡的谷胱甘肽代谢在JE发生后呈现先上调后显著下调的趋势,提示早期脑内促使谷胱甘肽的合成以应答脑炎发生后所释放的大量氧化应激产物,而随着JE的进展逐步消耗性的降低,最终无法代偿其剧烈的炎症反应。部分代谢物质如N-乙酰天冬氨酸、磷酸肌酸作为衡量神经元功能及脑内能量代谢的指标,其含量随着JE进展显著降低,同样证实了脑内神经元的严重损伤。鉴于前面细胞水平的研究显示Gln具有显著的抗病毒作用,结合其在JE晚期时含量呈现显著降低,我们拟进一步在在体水平评估Gln在JEV感染中的治疗潜能。通过构建JEV感染致小鼠脑炎模型并在感染后的第1天至第5天进行Gln腹腔给药,发现其在高剂量攻毒小鼠模型中可在一定程度延长其中位生存时间,在低剂量攻毒小鼠模型中则可在一定程度上提高小鼠的生存率,这些结果初步表明了 Gln对于JEV感染小鼠的增益作用,提示其作为治疗手段的可行性。研究结论综上,本研究以JEV的嗜神经性为出发点,通过JEV感染神经元的细胞模型及JEV致小鼠脑炎的动物模型,对JEV感染后引起的宿主细胞的代谢重编程及JE发生发展过程中脑内的代谢特征进行系统性描述。同时明确了 JEV病毒颗粒及NS1蛋白均可诱导AMPK信号通路的活化从而参与神经元的代谢重编程。通过葡萄糖的剥夺、糖酵解途径及磷酸戊糖途径的干预,明确了 JEV复制对于糖代谢的依赖性。研究首次发现Gln-Glu-AKG轴对JEV的复制发挥着显著的抑制作用,而通过阻断Gln生成AKG或抑制AKG在TCA循环的利用均可以抵消其抑制作用。继而进一步在在体水平证明了 Gln治疗的有效性。为JEV感染与宿主细胞在代谢层面的相互作用提供了实验依据,并为以代谢为干预靶点的病毒感染性疾病的治疗提供了初步探索。