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研究背景:自间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)被发现以来,其自我更新能力及多向分化潜能受到了组织工程领域的广泛关注。由于人牙髓间充质干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)可从牙髓组织中获取,且具有较高的安全性,被认为是牙髓牙本质再生的关键。在过去的十年中,hDPSCs还被应用于自体干细胞移植,已成为组织工程及再生医学领域的种子细胞,受到了广泛的关注及应用。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA分子,已有大量研究证实它主要作为miRNAs的分子海绵,进而间接调节下游靶基因的表达,从而实现对机体各种生理病理过程的调控。作为最早被鉴定的lncRNA之一,lncRNA H19的生物学功能受到了关注。研究表明,其在肿瘤发生发展及细胞分化等方面发挥着重要的调控作用。目前有关lncRNA在主要几种人类口腔间充质干细胞中的作用机制的报道尚少,本课题组前期研究已证实,H19在体外可正向调控hDPSCs的成牙本质向分化过程,但其调控机制尚待进一步阐明。H19调控hDPSCs成牙本质向分化的机制研究,可为牙髓牙本质再生提供分子水平的理论基础和新的治疗靶点。研究目的:(1)体内实验进一步证实H19促进hDPSCs成牙本质向分化的功能(2)阐明H19调控hDPSCs成牙本质向分化的分子机制。研究方法:(1)构建裸鼠异位成骨动物模型,运用Micro-CT扫描、苏木素伊红(H&E)染色、Masson染色、免疫组织化学实验验证H19的体内功能。(2)通过生物信息学分析结合荧光素酶报告基因实验,预测及确认H19结合的mi RNA及其调控的下游靶基因。(3)通过细胞转染技术使hDPSCs过表达miR-140-5p,经成牙本质向分化诱导培养后,应用qRT-PCR实验及Western blot实验检测矿化相关基因ALP、RUNX2、DSPP、DMP-1的表达水平、茜素红染色实验探讨miR-140-5p的生物学功能。(4)在hDPSCs成牙本质向分化诱导培养过程中分别加入人重组蛋白BMP-2(rhBMP-2)或FGF9(rhFGF9),应用qRT-PCR实验、Western blot实验和茜素红染色实验分别探讨BMP-2及FGF9的生物学功能。(5)在hDPSCs中同时转入H19过表达载体和miR-140-5p mimics,经成牙本质向分化诱导培养后进行挽救实验,验证在hDPSCs成牙本质向分化过程中H19对mi R-140-5p的拮抗效应。研究结果:(1)体内实验证明过表达H19可增加hDPSCs新生牙本质样结构组织的异位形成,H19在体内可促进hDPSCs的成牙向分化。(2)通过生物信息学分析结合荧光素酶报告基因实验表明H19与miR-140-5p存在相互结合作用。上调miR-140-5p可抑制hDPSCs的成牙本质向分化。(3)通过数据库预测出miR-140-5p分别与BMP-2和FGF9的3’UTR存在靶向结合关系,利用双荧光素酶报告基因实验确定它们为miR-140-5p调控的靶基因。mi R-140-5p可负向调节靶基因BMP-2和FGF9的表达,且经成牙本质向分化诱导培养后hDPSCs中BMP-2和FGF9的表达水平上升。在诱导培养过程中分别加入人重组蛋白BMP-2、FGF9,可促进hDPSCs的成牙本质向分化。(4)H19过表达载体与miR-140-5p mimics共转染的挽救实验表明H19通过吸附mi R-140-5p促进hDPSCs的成牙本质向分化。研究结论:H19在体内可促进hDPSCs成牙本质向分化。其调控机制是:H19通过吸附mi R-140-5p调节其下游靶基因BMP-2和FGF9的表达,进而促进hDPSCs的成牙本质向分化。