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目的：
本研究通过构建孕期炎症刺激跨代遗传模型，来验证PIE导致子代高血压的遗传特性。考虑到EH的发生是由遗传和环境因素相互作用的结果，本课题拟从表观遗传学机制入手，研究孕期炎症刺激致子代血压升高跨代遗传的分子机制，进而为EH的防治及新药研究提供新的实验资料和理论依据。
方法:
1.1孕期炎症刺激跨代遗传模型子代表型的检测
1.2孕期炎症刺激跨代遗传模型子代血管结构及动脉功能检测
1.3孕期炎症刺激跨代遗传模型子代大鼠血压增高的表观遗传学机制研究
结果:
2.1孕期炎症刺激跨代遗传模型子代表型的改变
2.1.1给予F0代孕鼠腹腔注射LPS或Ploy I∶C进行孕期炎症刺激，无论是持续性刺激还是一过性刺激，其F2子代大鼠的收缩压均高于对照组，差异具有统计学意义;F3-LPS-P和F4-LPS-P的收缩压与对照组相比也出现显著性升高;这表明本课题组前期研究所发现的PIE所致F1子代血压升高的表型具有跨代遗传的特性，且至少可以遗传至F2～F4多代。
2.1.2虽然前期研究显示PIE F1子代出现体重增加、血糖和血脂上升的代谢表型改变，但未观察到这些代谢表型继续传递至F2代，PIE F2子代的体重、空腹血糖和血脂含量与对照组相比未见明显差异。
2.1.3PIE子代大鼠对高脂饮食、STZ造模糖尿病、AngⅡ造模高血压（疾病危险因素）的敏感性
2.2孕期炎症刺激子代血管结构及功能的改变
2.2.1HE结果显示，与对照组相比，F2-LPS-P大鼠胸主动脉出现明显的结构损伤、管壁增厚以及壁厚/管腔直径比增加的现象，而管腔直径没有显著性差异，提示出现了血管重构的现象;而F2-LPS-P大鼠肠系膜上动脉较对照组仅出现管腔直径增大，血管壁厚和壁厚/管腔直径比无差异;对胸主动脉和肠系膜上动脉组织的eNOS和p-eNOS免疫荧光染色结果显示F2-LPS-P血管内皮出现了结构改变;上述结果提示孕期炎症刺激导致F2子代的传导动脉在血压升高过程中出现更加显著的血管重构。
2.2.2离体血管环实验中，F2-LPS-P大鼠胸主动脉和肠系膜上动脉对PE的收缩反应性显著高于对照组，而Ach引起的血管舒张在两组间无差异，说明PIE致F2子代出现了以动脉对缩血管物质的反应性增强为特征的血管反应性变化。胸主动脉环去内皮后，两组的收缩反应性皆增强而舒张反应性皆减弱，去除内皮层消除了F2-LPS-P与对照组动脉之间血管收缩强度的差异，提示这种作用是内皮依赖性的。在加入eNOS抑制剂L-NAME的离体动脉环实验中，L-NAME对eNOS的抑制增加了F2-LPS-P和对照组大鼠胸主动脉的收缩强度，但F2-LPS-P的血管收缩反应对这种抑制作用的反应比对照组弱，提示F2-LPS-P血管中eNOS的活性和缓冲能力降低。
2.2.3采用AngⅡ缓释灌注构建高血压模型的方法对F2子代进行再刺激，F2-LPS-P大鼠胸主动脉和肠系膜上动脉的血管收缩强度仍然显著高于对照组，提示PIE会导致F2子代对AngⅡ这一高血压危险因素仍具有较强的敏感性。
2.3孕期炎症刺激致跨代遗传模型子代大鼠血压增高的表观遗传机制
2.3.1F2-LPS-P的胸主动脉、肠系膜上动脉、心脏组织中血管紧张素转化酶(ACE)显著性升高，并且胸主动脉具有明显的血管重构和动脉功能改变，提示其心血管系统中胸主动脉病理性改变更为显著，因此以胸主动脉为样本代表研究F2子代的表观遗传学改变。经过MeDIP-seq分析，与对照组相比，F2-LPS-P的全基因组甲基化状态发生了改变，存在1696个高甲基化差异甲基化区(DMRs)和1111个低甲基化DMRs（甲基化改变＞1.5倍和edge-P-vNue＜1×10-4的基因座）。BSP验证F2对照和F2-LPS-P胸主动脉组织DNA甲基化的结果显示，具有差异倍数最大或位于启动子区域内的3个高甲基化（Fgff2，Pfdn1和Srpk2）和3个低甲基化（Cfhr1，Ndrg2和Cox7a2l）DMRs的甲基化水平与MeDIP-seq数据所得结果一致。大多数高甲基化和低甲基化DMRs位于内含子元件相关区域中，与高甲基化DMRs相比，低甲基化DMRs更多地分布在近端启动子区-转录起始位点（Promoter-TSS）和转录终止位点(TTS)的区域。
2.3.2David GO生物过程(BP)富集和KEGG分析显示，高甲基化DMRs相关基因主要富集于脑和神经系统发育、突触组装、cAMP和TGF-β信号转导途径;低甲基化DMRs相关基因主要富集于RNA转录和基因表达的正调控、内皮细胞迁移、NF-KB转录因子活性、MAPK激活、Ras和JAK/STAT信号通路，这些与心血管病理改变和血管重塑信号通路的激活有关;这些结果提示低甲基化DMRs相关基因主要参与PIE子代高血压及CVD的发生。
2.3.3用Ingenuity⑩通路分析(IPA)软件包对与血压增高机制密切相关的低甲基化DMRs进行进一步的经典通路富集和IPA相互作用网络分析。结果显示，在低甲基化DMRs相关基因中，显著富集了数种与血管重塑和高血压发病机制相关的信号转导通路，例如Gβγ、JAK/STAT、肾素-血管紧张素、LPS刺激的MAPK、p53、p70S6K、GPCR、和ERK/MAPK信号通路。其中Gβγ信号转导是低甲基化DMRs相关基因富集的第4个最重要的经典通路。IPA网络相互作用分析表明Gβγ信号转导与GPCR、JAK/STAT、LPS刺激的MAPK、ERK/MAPK信号转导密切相关。这表明Gβγ信号通路中的低甲基化DMRs与基因簇可能在PIE-F2子代的血管病变和高血压发生中起关键作用。
2.3.4通过Real-time PCR和BSP分别验证F2子代胸主动脉Gβγ信号转导途径基因mRNA表达水平和启动子区域内DNA甲基化状态。结果表明，F2-LPS-P组Gβγ信号通路中低甲基化DMRs相关基因的mRNA表达皆有增加的趋势，其中Sos1、Sos2、Gng10、Prkacb、Pik3c3的表达上调具有统计学差异;BSP结果显示，与F2对照组相比，PIE F2-LPS-P子代的胸主动脉中Sos1，Sos2，Gng10和Prkacb启动子区域内甲基化DNA的比例显著降低;通过鉴定F1子代精子的甲基化状态来验证跨代遗传的证据，分离F1雄性尾部附睾的精子后，用BSP检测在胸主动脉中发生甲基化改变的Gβγ相关DMRs基因的甲基化水平，结果显示PIE F1-LPS-P精子中Sos1、Sos2、Gng10和Prkacb的甲基化模式与PIE F2-LPS-P子代胸主动脉中的相似。上述结果表明，富集于Gβγ信号转导通路的DMRs基因甲基化水平降低可能在PIE致高血压疾病跨代遗传的发生机制中起重要作用。
2.3.5Gβγ信号通路能够与PI3K ClassⅠp110β相结合从而激活PI3K信号通路。PI3K-Akt信号通路的激活在血管平滑肌细胞增殖和血管张力反应的调节中发挥关键作用，其过度活化通常与血管重塑和病理改变有关。对PI3K-Akt信号转导的关键下游效应分子的活性进行分析，Western-blot结果显示PIE F2-LPS-P子代胸主动脉中mTORC1和mTORC2的底物Akt和S6的磷酸化水平较对照组显著升高，而Akt和S6的总蛋白水平与对照组无明显差异，这表明PI3K-Akt信号转导的活性在PIE F2子代中增强。用离体血管环反应实验评估PI3K-Akt活化在PIE F2-LPS-P子代的胸主动脉收缩增强效应中的作用，实验显示PI3K抑制剂LY294002的处理显著逆转了增强的PE诱导的PIE F2-LPS-P子代胸主动脉收缩反应，两组的收缩强度皆显著性降低且原有的组间差异消失。此外，LY290042处理后PIE F2-LPS-P子代和F2对照组之间Ach诱导的胸主动脉血管舒张仍未见差异。上述结果证实了PI3K信号转导通路在F2-LPS-P子代血管收缩功能增强及高血压发病中的重要作用。
结论:
3.1在本室既往孕期LPS或Poly I∶C刺激致子代大鼠高血压模型的基础上，建立了孕期LPS/Poly I∶C刺激致子代血压升高的跨代遗传模型。
3.2PIE F2-LPS-P子代大鼠出现了以动脉对缩血管物质反应性增强为特征的血管反应性的变化，且与阻力动脉（肠系膜上动脉）相比，传导动脉（胸主动脉）血管重构的现象更为严重。
3.3PIE F2-LPS-P子代大鼠与对照组比较，对AngⅡ这一高血压危险因素的敏感性明显升高，可能是其易发高血压的重要原因。
3.4PIE F2-LPS-P子代大鼠全基因组甲基化状态发生改变，其中低甲基化DMRs相关基因富集的GO和信号转导通路与血管重构及高血压发生机制紧密相关。
3.5PIE导致F2子代胸主动脉和F1子代精子富集于Gβγ信号转导通路的DMRs基因的启动子区域低甲基化，通过影响F2子代PI3K/Akt信号转导通路，进而导致以对缩血管物质反应性增强为特征的血管反应性的变化和子代高血压的发生。
本研究通过构建孕期炎症刺激跨代遗传模型，来验证PIE导致子代高血压的遗传特性。考虑到EH的发生是由遗传和环境因素相互作用的结果，本课题拟从表观遗传学机制入手，研究孕期炎症刺激致子代血压升高跨代遗传的分子机制，进而为EH的防治及新药研究提供新的实验资料和理论依据。
方法:
1.1孕期炎症刺激跨代遗传模型子代表型的检测
1.2孕期炎症刺激跨代遗传模型子代血管结构及动脉功能检测
1.3孕期炎症刺激跨代遗传模型子代大鼠血压增高的表观遗传学机制研究
结果:
2.1孕期炎症刺激跨代遗传模型子代表型的改变
2.1.1给予F0代孕鼠腹腔注射LPS或Ploy I∶C进行孕期炎症刺激，无论是持续性刺激还是一过性刺激，其F2子代大鼠的收缩压均高于对照组，差异具有统计学意义;F3-LPS-P和F4-LPS-P的收缩压与对照组相比也出现显著性升高;这表明本课题组前期研究所发现的PIE所致F1子代血压升高的表型具有跨代遗传的特性，且至少可以遗传至F2～F4多代。
2.1.2虽然前期研究显示PIE F1子代出现体重增加、血糖和血脂上升的代谢表型改变，但未观察到这些代谢表型继续传递至F2代，PIE F2子代的体重、空腹血糖和血脂含量与对照组相比未见明显差异。
2.1.3PIE子代大鼠对高脂饮食、STZ造模糖尿病、AngⅡ造模高血压（疾病危险因素）的敏感性
2.2孕期炎症刺激子代血管结构及功能的改变
2.2.1HE结果显示，与对照组相比，F2-LPS-P大鼠胸主动脉出现明显的结构损伤、管壁增厚以及壁厚/管腔直径比增加的现象，而管腔直径没有显著性差异，提示出现了血管重构的现象;而F2-LPS-P大鼠肠系膜上动脉较对照组仅出现管腔直径增大，血管壁厚和壁厚/管腔直径比无差异;对胸主动脉和肠系膜上动脉组织的eNOS和p-eNOS免疫荧光染色结果显示F2-LPS-P血管内皮出现了结构改变;上述结果提示孕期炎症刺激导致F2子代的传导动脉在血压升高过程中出现更加显著的血管重构。
2.2.2离体血管环实验中，F2-LPS-P大鼠胸主动脉和肠系膜上动脉对PE的收缩反应性显著高于对照组，而Ach引起的血管舒张在两组间无差异，说明PIE致F2子代出现了以动脉对缩血管物质的反应性增强为特征的血管反应性变化。胸主动脉环去内皮后，两组的收缩反应性皆增强而舒张反应性皆减弱，去除内皮层消除了F2-LPS-P与对照组动脉之间血管收缩强度的差异，提示这种作用是内皮依赖性的。在加入eNOS抑制剂L-NAME的离体动脉环实验中，L-NAME对eNOS的抑制增加了F2-LPS-P和对照组大鼠胸主动脉的收缩强度，但F2-LPS-P的血管收缩反应对这种抑制作用的反应比对照组弱，提示F2-LPS-P血管中eNOS的活性和缓冲能力降低。
2.2.3采用AngⅡ缓释灌注构建高血压模型的方法对F2子代进行再刺激，F2-LPS-P大鼠胸主动脉和肠系膜上动脉的血管收缩强度仍然显著高于对照组，提示PIE会导致F2子代对AngⅡ这一高血压危险因素仍具有较强的敏感性。
2.3孕期炎症刺激致跨代遗传模型子代大鼠血压增高的表观遗传机制
2.3.1F2-LPS-P的胸主动脉、肠系膜上动脉、心脏组织中血管紧张素转化酶(ACE)显著性升高，并且胸主动脉具有明显的血管重构和动脉功能改变，提示其心血管系统中胸主动脉病理性改变更为显著，因此以胸主动脉为样本代表研究F2子代的表观遗传学改变。经过MeDIP-seq分析，与对照组相比，F2-LPS-P的全基因组甲基化状态发生了改变，存在1696个高甲基化差异甲基化区(DMRs)和1111个低甲基化DMRs（甲基化改变＞1.5倍和edge-P-vNue＜1×10-4的基因座）。BSP验证F2对照和F2-LPS-P胸主动脉组织DNA甲基化的结果显示，具有差异倍数最大或位于启动子区域内的3个高甲基化（Fgff2，Pfdn1和Srpk2）和3个低甲基化（Cfhr1，Ndrg2和Cox7a2l）DMRs的甲基化水平与MeDIP-seq数据所得结果一致。大多数高甲基化和低甲基化DMRs位于内含子元件相关区域中，与高甲基化DMRs相比，低甲基化DMRs更多地分布在近端启动子区-转录起始位点（Promoter-TSS）和转录终止位点(TTS)的区域。
2.3.2David GO生物过程(BP)富集和KEGG分析显示，高甲基化DMRs相关基因主要富集于脑和神经系统发育、突触组装、cAMP和TGF-β信号转导途径;低甲基化DMRs相关基因主要富集于RNA转录和基因表达的正调控、内皮细胞迁移、NF-KB转录因子活性、MAPK激活、Ras和JAK/STAT信号通路，这些与心血管病理改变和血管重塑信号通路的激活有关;这些结果提示低甲基化DMRs相关基因主要参与PIE子代高血压及CVD的发生。
2.3.3用Ingenuity⑩通路分析(IPA)软件包对与血压增高机制密切相关的低甲基化DMRs进行进一步的经典通路富集和IPA相互作用网络分析。结果显示，在低甲基化DMRs相关基因中，显著富集了数种与血管重塑和高血压发病机制相关的信号转导通路，例如Gβγ、JAK/STAT、肾素-血管紧张素、LPS刺激的MAPK、p53、p70S6K、GPCR、和ERK/MAPK信号通路。其中Gβγ信号转导是低甲基化DMRs相关基因富集的第4个最重要的经典通路。IPA网络相互作用分析表明Gβγ信号转导与GPCR、JAK/STAT、LPS刺激的MAPK、ERK/MAPK信号转导密切相关。这表明Gβγ信号通路中的低甲基化DMRs与基因簇可能在PIE-F2子代的血管病变和高血压发生中起关键作用。
2.3.4通过Real-time PCR和BSP分别验证F2子代胸主动脉Gβγ信号转导途径基因mRNA表达水平和启动子区域内DNA甲基化状态。结果表明，F2-LPS-P组Gβγ信号通路中低甲基化DMRs相关基因的mRNA表达皆有增加的趋势，其中Sos1、Sos2、Gng10、Prkacb、Pik3c3的表达上调具有统计学差异;BSP结果显示，与F2对照组相比，PIE F2-LPS-P子代的胸主动脉中Sos1，Sos2，Gng10和Prkacb启动子区域内甲基化DNA的比例显著降低;通过鉴定F1子代精子的甲基化状态来验证跨代遗传的证据，分离F1雄性尾部附睾的精子后，用BSP检测在胸主动脉中发生甲基化改变的Gβγ相关DMRs基因的甲基化水平，结果显示PIE F1-LPS-P精子中Sos1、Sos2、Gng10和Prkacb的甲基化模式与PIE F2-LPS-P子代胸主动脉中的相似。上述结果表明，富集于Gβγ信号转导通路的DMRs基因甲基化水平降低可能在PIE致高血压疾病跨代遗传的发生机制中起重要作用。
2.3.5Gβγ信号通路能够与PI3K ClassⅠp110β相结合从而激活PI3K信号通路。PI3K-Akt信号通路的激活在血管平滑肌细胞增殖和血管张力反应的调节中发挥关键作用，其过度活化通常与血管重塑和病理改变有关。对PI3K-Akt信号转导的关键下游效应分子的活性进行分析，Western-blot结果显示PIE F2-LPS-P子代胸主动脉中mTORC1和mTORC2的底物Akt和S6的磷酸化水平较对照组显著升高，而Akt和S6的总蛋白水平与对照组无明显差异，这表明PI3K-Akt信号转导的活性在PIE F2子代中增强。用离体血管环反应实验评估PI3K-Akt活化在PIE F2-LPS-P子代的胸主动脉收缩增强效应中的作用，实验显示PI3K抑制剂LY294002的处理显著逆转了增强的PE诱导的PIE F2-LPS-P子代胸主动脉收缩反应，两组的收缩强度皆显著性降低且原有的组间差异消失。此外，LY290042处理后PIE F2-LPS-P子代和F2对照组之间Ach诱导的胸主动脉血管舒张仍未见差异。上述结果证实了PI3K信号转导通路在F2-LPS-P子代血管收缩功能增强及高血压发病中的重要作用。
结论:
3.1在本室既往孕期LPS或Poly I∶C刺激致子代大鼠高血压模型的基础上，建立了孕期LPS/Poly I∶C刺激致子代血压升高的跨代遗传模型。
3.2PIE F2-LPS-P子代大鼠出现了以动脉对缩血管物质反应性增强为特征的血管反应性的变化，且与阻力动脉（肠系膜上动脉）相比，传导动脉（胸主动脉）血管重构的现象更为严重。
3.3PIE F2-LPS-P子代大鼠与对照组比较，对AngⅡ这一高血压危险因素的敏感性明显升高，可能是其易发高血压的重要原因。
3.4PIE F2-LPS-P子代大鼠全基因组甲基化状态发生改变，其中低甲基化DMRs相关基因富集的GO和信号转导通路与血管重构及高血压发生机制紧密相关。
3.5PIE导致F2子代胸主动脉和F1子代精子富集于Gβγ信号转导通路的DMRs基因的启动子区域低甲基化，通过影响F2子代PI3K/Akt信号转导通路，进而导致以对缩血管物质反应性增强为特征的血管反应性的变化和子代高血压的发生。