论文部分内容阅读
目的观察氯化钻(CoCl2)在体外模拟缺氧对绒癌JEG-3细胞增殖能力的影响,进而确立合适的绒癌JEG-3细胞的体外缺氧模型。并在该缺氧模型基础上观察不同程度缺氧对绒癌JEG-3细胞侵袭能力的影响,并探讨可能的影响机制。方法(1)经不同浓度的CoCl2(0、50、100、150.200μmol/L)和不同作用时间(24h、48h、72h、96h)培养诱导绒癌JEG-3细胞缺氧,用CCK-8法检测缺氧对绒毛膜癌JEG-3细胞增殖活性的影响。(2)以150μmol/l浓度的CoCl2分别作用绒癌JEG-3细胞24h、48h、72h建立绒癌JEG-3细胞体外缺氧模型。运用荧光定量-聚合酶链反应(real time-polymerase chain reaction,real time-PCR)及蛋白免疫印迹(Western blotting)方法,分别检测各实验组绒癌JEG-3细胞的HIF-1α及VEGF的mRNA和蛋白水平的表达；运用transwell侵袭实验检测各实验组绒癌JEG-3细胞的侵袭能力。结果(1)用CCK-8测定在不同浓度CoCl2作用不同时间下的绒癌JEG-3细胞的增殖活性。结果示在一定浓度下(≤150μmol/l)和作用时间(72h)范围内,CoCl2诱导的缺氧可以一定程度的促进绒癌JEG-3细胞的生长增殖,并呈浓度和时间的正相关性；而当作用浓度增加(达到20μmol/l)或延长处理时间(96h)时均会不同程度的降低JEG-3细胞的增殖活性。(2) real-time-PCR检测结果示缺氧不能刺激HIF-1α mRNA的表达增加。缺氧24h组、缺氧48h组、缺氧72h组的HIF-1α mRNA的表达分别为常氧对照组的HIF-1α mRNA表达的1.17倍、0.98倍、1.04倍。HIF-1α的下游重要靶基因VEGF随着诱导缺氧时间的延长(24h、48h、72h)其mRNA表达水平逐渐增高。缺氧24h组、缺氧48h组、缺氧72h组的VEGF mRNA的表达分别为常氧对照组VEGF mRNA表达的2.62倍、4.79倍、5.66倍。(3)蛋白免疫印迹Western blotting检测结果示在缺氧下HIF-1α及VEGF蛋白水平的表达均增强。HIF-1α在缺氧24h时的蛋白表达相对灰度值为(0.42±0.01),并在缺氧48h时蛋白表达最高。缺氧48h组(0.64±0.03)与缺氧72h组(0.65±0.02)间差异无统计学意义(p>0.05)。各缺氧组与常氧组(0.26±0.01)比较,差异有统计学意义(p<0.05)。绒癌JEG-3细胞中VEGF蛋白水平的表达随着缺氧时间延长表达逐渐增强。其中,常氧组VEGF蛋白表达灰度值为(0.28±0.02),缺氧24h组为(0.46±0.02),缺氧48h组为(0.94±0.03),缺氧72h组为(1.26±0.02)。各缺氧组与常氧组比较差异均有统计学意义(p<0.05)。缺氧各组分别与其前一缺氧时间组比较,差异均有统计学意义(p<0.05)。(4) Transwell侵袭实验测缺氧下绒癌JEG-3细胞侵袭力的变化。Transwell结果显示在400×下观察JEG-3细胞的穿膜细胞数分别为常氧对照组(31±5),缺氧24h组(33±4),缺氧48h组(40±3),缺氧72h组(50±5)。与常氧对照组比较,缺氧24h组JEG-3细胞数稍增加,但无统计学差异(p>0.05)；缺氧48h组及缺氧72h组JEG-3细胞穿膜数目显著增加,差异有统计学意义(p<0.05)。且缺氧各组分别与其前一缺氧时间组比较,差异均有统计学意义(p<0.05)。结论(1)通过CoCl2可建立绒癌JEG-3细胞体外缺氧模型。且CoCl2在一定浓度及作用时间范围内对绒癌JEG-3细胞有促进其生存及增强增殖活性的作用。(2)缺氧不能使绒癌JEG-3细胞的HIF-1α mRNA表达增强,但可使HIF-1α的蛋白水平表达增强,表明CoCl2可使绒癌JEG-3细胞HIF-1α在转录后水平表达增强。同时可使HIF-1α的下游重要靶基因VEGF mRNA及蛋白水平表达均增加。(3)缺氧可以促进绒癌JEG-3细胞的侵袭能力,可能与其在缺氧状态下HIF-1α的蛋白表达增强及诱导下游的VEGF的表达增加有关。