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芦笋(AsparagusofficinalisL.)又名石刁柏、龙须菜,系百合科(Liliaceae)天门冬属(Asparagus)雌雄异株宿根性植物,也是重要的经济作物之一。芦笋的遗传组成为2n=2x=20,基因组大小为1,323Mb。由于其嫩茎脆而多汁,风味鲜美,世界各地已广泛栽培。目前研究认为其性别决定的二型性是由位于L5染色体上的一个显性基因M决定的,雌株是隐性纯合子mm,雄株是显性纯合子MM或杂合子Mm,由于雄株比雌株高产25%以上,并具有极强的抗病性和生命力,故雄株特别是超雄株则倍受生产者的青睐,但即便在开花时期,MM和Mm从表型上也不能区分,而用经典的测交方法进行鉴定既费时又费力,因此,若能用现代分子生物学方法获得一种共显性的性别连锁标记,就可快速鉴定MM基因型,从而也就加速了育种过程,在生产实践中具有重要的实用价值。
鉴于此,本文以芦笋(UC309)为材料,从细胞学、同工酶及RAPD分子标记等方面分别对芦笋的雌雄株之间的差异进行了比较性研究,以期为芦笋的性别决定和分化机制提供可靠的理论依据,为克隆其性别相关基因奠定基础。主要结果如下:
1、利用去壁低渗的方法,对芦笋的核型进行了研究,结果表明芦笋的性别决定类型为XY型,雄株为XY,其核型公式为2n=2x=20=13m(2SAT)+7sm(SAT);雌株为XX,其核型公式2n=2x=20=12m(2SAT)+8sm;核型类型为2B型,属于较原始的类型。其性染色体为异形染色体。
2、采用细胞遗传学方法对芦笋花粉母细胞的减数分裂过程进行了观察,发现了两种特殊的的现象:一种是存在一对不能完全配对的二价体,二是染色体在由前Ⅰ期向中Ⅰ期转变过程中,可以看到染色体的滞后现象。
3、对芦笋染色体进行银染研究,结果显示出了端粒带。
4、采用聚丙烯酰胺不连续垂直平板凝胶电泳技术,对芦笋雌雄株幼嫩叶片中的过氧化物酶(POD)、酯酶(EST)、谷氨酸脱氢酶(GDH)和淀粉酶(AMY)等同工酶进行了比较分析。结果表明芦笋雌雄株之间的过氧化物酶及酯酶同工酶酶谱存在显著差异:过氧化物酶在雄株中比在雌株中多了Rf值为0.86的一条酶带;酯酶在雄株中多了Rf值为0.18和0.30的两条酶带。谷氨酸脱氢酶和淀粉酶在雌雄株间具有相同的酶谱带,没有表现出性别差异。
5、利用随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术对芦笋雌雄株的性别差异进行了比较性研究。在100个随机引物中,仅引物S12和S368在芦笋中扩增共得到3条雌性相关的RAPD标记,它们长度分别为867bp、928bp、1178bp(Genbank注册号分别为AY957538、AY957392、AY957539),AT含量分别为61%、62%、64%,属于富含AT的序列。根据序列分析结果将长度分别为867bp和928bp片段分别转化为重复性和特异性更好的SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregions)标记,经检测发现这两个片段是非常稳定的雌性芦笋的分子标记。