中药多糖是大分子物质,主要具有免疫调节活性及抗肿瘤作用。多采用苯酚-浓硫酸比色法测定总多糖的含量,关于指纹图谱的研究较少。中药指纹图谱技术是国内外公认最有效的中药质控方法。本研究选择含有多糖成分的中药复方灵芝皇胶囊(由灵芝、黄精、枸杞子、麦冬、白术、茯苓、五味子等药材组成)及其含有较多多糖成分的组方药材灵芝、黄精、枸杞子、麦冬为研究对象,采用中药指纹图谱技术,建立多糖酸水解指纹图谱的方法,及初步鉴别各多糖结构组成,以期得到多糖酸水解指纹图谱的共性方法。目的:1、探讨灵芝皇胶囊及其组方药材灵芝、黄精、麦冬、枸杞子酸水解柱前衍生-HPLC图谱方法的可行性。2.筛选灵芝皇胶囊及其组方药材灵芝、黄精、麦冬、枸杞子供试品溶液的制备方法,及评价多糖的稳定性。3、比较建立的灵芝、黄精、枸杞子、麦冬指纹图谱共有模式的差异及共性。方法:1、采用中药HPLC特征图谱技术,建立灵芝皇胶囊及其组方药材灵芝、黄精、麦冬、枸杞子多糖的HPLC图谱分析方法,各分析10批样品,采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)进行相似度分析,生成特征图谱共有模式。2、筛选样品多糖提取方法,采用在温度为110℃,0.4mol/L三氟乙酸(TFA)水解,以0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为衍生化试剂,筛选水解时间和衍生时间。3、建立灵芝皇胶囊、灵芝、黄精、枸杞子、麦冬多糖酸水柱前衍生-HPLC指纹图谱分析方法,分别生成指纹图谱共有模式,并进行相似度评价,并探讨灵芝皇胶囊主要特征峰与单位药材的峰位归属。4、采用单糖对照品保留时间定性,分别鉴别以上样品多糖的单糖构成。5、对灵芝、黄精、枸杞子、麦冬多糖酸水解柱前衍生生成的指纹图谱共有模式进行比较,探讨其共性与差异。成果:1、建立的灵芝皇胶囊多糖酸水解柱前衍生-HPLC指纹图谱的方法具有可行性,并基本明确峰位归属。(1)确定了灵芝皇胶囊多糖溶液浓度为0.18g/mL,乙醇醇沉浓度为80%,进样量为10 μL。确定了灵芝皇胶囊多糖溶液的最佳水解时间为6 h,衍生时间为60 min。(2)10批样品共标示出14个共有特征峰,相似度为0.976-0.997。鉴别了 8个特征峰,分别为D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-岩藻糖。其中,峰10(D-葡萄糖)是最强峰,占总峰面积的85.0%以上。(3)主要归属灵芝、麦冬、白术、茯苓;其次为峰11(D-半乳糖),主要归属灵芝、黄精、麦冬、茯苓;峰1(D-甘露糖)主要归属药材麦冬、茯苓、五味子;峰14(L岩藻糖)主要归属灵芝、白术、茯苓。2、建立可行的灵芝、黄精、麦冬和枸杞子多糖酸水解柱前衍生-HPLC指纹图谱的方法,方法学符合中药指纹图谱技术要求。(1)确定了灵芝、黄精、枸杞子和麦冬多糖溶液生药浓度分别为0.20g/mL、0.25 g/mL、0.30g/mL、0.25g/mL;乙醇醇沉浓度均为80%;供试品溶液浓度分别为0.04 g/mL、0.025 g/mL、0.06 g/mL、0.025 g/mL;进样量分别为 30 μL、20μL、30μL、30μL;确定了其多糖溶液的最佳水解时间分别为6h、7h、6h、6h,衍生时间为100min、40 min、60 min、60 min。(2)10批灵芝多糖样品共标示出12个共有峰,相似度达到0.973-0.992。鉴别出七个色谱峰,分别为D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、L岩藻糖等组成的,其中主要由D-葡萄糖(70%)组成,其次为D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖。(3)10批黄精多糖标示出10个共有峰,相似度非常高(均大于0.99)。鉴别出7个色谱峰,分别为D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖。以D-半乳糖(55%)为主,其次为D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-甘露糖。(4)10批枸杞子共标出12个共有峰,相似度非常高(均大于0.99)。鉴别出8个色谱峰,分别为D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖。阿拉伯糖(45%))最高,其次为D-半乳糖、D-木糖、D-半乳糖醛酸。(5)10批麦冬标示出9个共有峰,相似度较高,大于0.98。鉴别出8个色谱峰,分别为D-甘露糖L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-岩藻糖。以D-半乳糖(50.0%)最高,其次为D-甘露糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖。3、灵芝、黄精、枸杞子及麦冬多糖酸水解-HPLC指纹图谱的方法的共性及差异。(1)供试品溶液制备方法的共性①一般采用80%乙醇,超声1-2次,可去除脂溶性成分。②采用水提1-2次,多糖即可提取完全,粗多糖浓度为0.4g/mL-0.6g/mL;乙醇醇沉浓度为80%;供试品溶液浓度为0.025 g/mL-0.06 g/mL;进样量为10-30 u L均可行。③四种药材较优水解时间为6-7h,衍生时间一般在40-60min基本反应完全。(2)灵芝皇胶囊及组方药材多糖组成及差异。多糖主要是由D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-岩藻糖等组成,不同药材单糖比例相差较大。(3)灵芝、黄精、枸杞子与麦冬多糖酸水解柱前衍生-HPLC指纹图谱方法鉴别药材具有可行性。四种药材共有模式相似度比较,灵芝多糖与黄精、枸杞子、麦冬相似度分别为0.187、0.126、0.622;黄精与枸杞子、麦冬相似度非别为0.496、0.473;枸杞子与麦冬相似度分别为0.540,不同药材之间相似度很低,该方法具有可鉴别性。结论:(1)建立的中药多糖酸水解-HPLC指纹图谱的方法准确可行;(2)多糖的供试品溶液制备具有一定的共性;(3)不同药材多糖酸水解指纹图谱相似度很低,可用于鉴别不同药材;(4)通过相似度评价及特征峰的鉴别,初步掌握了以上中药复方及中药多糖的单糖组成,由于不同药材单糖组成比例不同,可用于中药复方及其单味药材多糖的质量控制。为其他中药多糖的质量控制提供方法依据。