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香蕉(Musa spp.)是重要的热带亚热带水果与粮食作物。然而,香蕉的生产正面临枯萎病等多种病虫害的严重威胁。香蕉栽培品种多为三倍体,具有高度不育性和单性结实的特点,难于通过传统的杂交育种方式获得抗性强的新品种。
诱变育种是香蕉新品种选育的重要途径,但人们对香蕉诱变规律的认识非常不足。在诱变育种过程中,结合使用形态学研究和DNA分子标记鉴定,有利于揭示诱变材料遗传物质的变异规律。
本研究以高抗目前香蕉生产最大威胁的枯萎病但生育期偏长、产量偏低的‘粤优抗1号’(M. spp. AAA Cavendish subgroup)香蕉新品种为试材,分别采用物理和化学两种方法对其组培苗茎尖进行诱变,对3组处理7个水平诱变处理材料、1组对照材料进行农艺性状调查,并采用ISSR和SRAP分子标记对诱变材料的形态学和分子遗传学变化规律进行评估,为香蕉育种做些基础性的探索工作,为日后的香蕉诱变育种提供理论基础。获得的主要研究结果如下:
(1)以3组处理7个水平、1组对照共500份香蕉材料为试材,统计了13个月的假茎高度、叶片数、抽蕾率等农艺性状,结果发现不同诱变处理在形态学上存在不同程度的差异。
(2)采用改良CTAB法成功地从香蕉叶片中提取了高质量基因组DNA。针对香蕉老叶片富含多糖、多酚等物质的特点,采用在细胞核被裂解之前,用CTAB—free缓冲液先除多糖,加入2% PVPP的方法来消除酚类物质干扰,两次加入β—巯基乙醇,有效抑制了多酚及其他物质的氧化。保证了后续分子标记分析的顺利进行。
(3)利用正交试验设计和二因素均匀试验设计相结合的方法优化了香蕉ISSR反应体系,从100条引物中筛选出22条多态性高、稳定性好的引物,并确定了每条引物最佳退火温度。
(4)运用上述优化的ISSR扩增体系,全面分析了7组处理、1组对照共82份香蕉材料的遗传变异情况。在ISSR分析中,用22条引物扩增获得了220条谱带;扩增多态性条带共75条,多态性带的比例为34.09%。利用NTSYSpc—2.1e软件进行聚类分析,获得树状图,结果表明诱变材料间实际相似系数较高,诱变材料在简单重复序列区间的变异较少。
(5)利用二因素均匀试验设计和单因素试验相结合的方法优化SRAP反应体系,探索出一套适合香蕉诱变材料遗传规律分析的SRAP反应体系。
(6)首次将SRAP分子应用于香蕉遗传分析,29对引物共扩增317条谱带,平均每对引物组合产生10.93条,共产生多态性带173条,比率为56.35%。利用NTSYSpc—2.1e软件进行聚类分析,获得树状图。诱变材料间实际相似系数最低0.87,说明诱变材料在开放阅读框内内含子的变异较多,通过该分子标记可以很好地区分诱变材料遗传变异上的差别。