镰刀菌和黄曲霉菌是世界上侵染小麦、玉米、水稻、花生等多种粮食和油料作物的病原真菌,不仅降低作物品质和产量,造成巨大的经济损失,还在侵染植物过程中产生多种真菌毒素,人、畜误食后会引起中毒,严重时可致癌症和死亡。中国是农业大国,粮食的生产和品质关系着国家的经济发展和社会稳定。因此,开展镰刀菌和黄曲霉菌控制技术研究,对于保障我国粮食稳产高产和食品安全,具有重要意义。由于天然抗性资源匮乏,已鉴定和开发的抗病资源有限,传统育种方法未能有效控制这些病原菌及其毒素的危害。长期以来,镰刀菌和黄曲霉菌的防治以化学杀菌剂为主,导致了严重的环境污染和生态环境问题,诱发了病原菌的抗药性和产毒量的增强。所以,开发对生态和环境安全的生物防治技术,具有广泛的应用前景。为此,我们分别以禾谷镰刀菌和黄曲霉菌为靶标病原真菌,通过微生物源生防菌株的分离、筛选、代谢物解析以及作用机理研究,获得多个高活性拮抗菌,鉴定了主要抑菌物质的化学结构和作用靶点,并用于田间及储藏期的病原菌防治。以镰刀菌为靶标病原菌取得的主要研究结果如下:1.抑制镰刀菌的芽孢杆菌筛选。从中国9个省的不同生态环境中采集样品160份,分离得到1809个菌株,其中12个菌株能显著抑制禾谷镰刀菌生长,进一步用于孢子萌发、苗期接种、田间单花接种和喷雾接种等拮抗作用分析,最终获得具有高效抑菌活性的3株芽孢杆菌(S76-3,DM-3,DK-1),其孢子萌发抑制率97%,小麦苗腐病抑制率为46%-57%,小麦穗腐病的抑制率为67%-80%。筛选得到的高效菌株S76-3用于镰刀菌的田间防治和抑菌机理研究;2.拮抗菌及其无菌上清液抑菌活性测定。以抑菌活性最强的解淀粉芽孢杆菌S76-3为材料,以活菌数为指标优化发酵条件,筛选得到一个最优培养基(红糖23.3g/L,豆粉11.1 g/L,Ca CO3 4.9 g/L,KNO3 8 g/L,KH2PO4 0.5g/L,K2HPO4 1.2 g/L,Mg SO4·7H2O 5 g/L,Na Cl 3 g/L),发酵后活菌数达1010/ml以上;收集发酵液菌体,添加助剂后制备可湿性粉剂,活菌数达109/g以上。S76-3可湿性粉剂与无菌上清液稀释后的田间试验表明,S76-3菌体和无菌上清液在不同年份和品种中均可有效防治小麦赤霉病,以2013年为例,无菌上清液处理后的病情指数可降低52%,小麦籽粒毒素含量降低76%,显著优于常用化学杀菌剂多菌灵;S76-3菌体处理可降低13%的病情指数的,43%的毒素,明显弱于多菌灵;3.抑菌物质化学结构解析。S76-3菌株基因组测序结合PCR分析表明,该菌株含有脂肽类物质编码基因;薄层色谱和液相色谱质谱连用仪分析证实,S76-3菌株主要产生依枯草菌素、丰原素和表面活性素;进一步将这3种物质经碰撞诱导解离和质谱分析(ESI-CID-MS)表明,S76-3产生的脂肽物质为依枯草菌素A、丰原素A/B和表面活性素,每类物质分别含有2-4种同系物;4.脂肽类物质抑菌机理。利用高效液相收集上述3种脂肽物质,配置成不同浓度后用于体外抑制镰刀菌活性以及抑菌机理研究,结果表明,表面活性素不具有抑菌活性,依枯草菌素A和丰原素A可高效抑菌镰刀菌;光学显微镜分析表明,这2种物质均可破坏镰刀菌菌丝和孢子结构,导致真菌细胞膨大后丧失活性;透射电镜分析显示,这2种物质主要引起真菌细胞壁穿孔和细胞膜破裂,导致细胞死亡;实时显微跟踪分析表明,依枯草菌素A主要作用于真菌菌丝的侧端导致凸起,丰原素主要作用于菌丝生长点,使其异常膨大。以黄曲霉菌为靶标病原菌取得的主要研究结果如下:1.产气拮抗菌筛选与鉴定。从100余株海洋细菌中,通过双皿对扣抑菌试验,筛选获得可产生抑菌性挥发气体、对黄曲霉菌菌丝生长和孢子萌发的抑制率高于80%的细菌5株,包括1株假单胞菌(Pseudomonas sp.)、1株希瓦氏菌YM8(Shewanella sp.)、2株葡萄球菌(Staphylococcus sp.)和1株微球菌(Micrococcus sp.),其中海藻希瓦氏菌YM8的抑菌活性最强,对黄曲霉菌、镰刀菌等9种重要植物病原真菌的抑制率均为100%。以海藻希瓦氏菌YM8为材料进行储藏期黄曲霉菌及其毒素防治和抑菌机理研究;2.抑菌气体的化学结构解析。利用气相色谱质谱连用仪(GC-MS)对YM8产生的挥发性气体物质进行分析,结果表明,YM8可产生15种挥发性物质,包括芳香族,烷类,硫化物,烯醇类,噁唑类,蒽类,酯类以及酚类等8类物质,其中二甲基三硫丰度最高,相对含量达14.195%。从15种物质中选取相似度高于70%,相对含量高于0.5%的6种物质进行抑菌试验,结果表明,2,4-二叔丁基苯酚和二甲基三硫的抑菌作用最强,分别在浓度为100μg/L和200μg/L(物质重量/空间体积)时可完全抑制黄曲霉菌丝的生长和孢子萌发;其余4种物质,2,4-二甲基噁唑、2-十二烷醇、丁基羟基甲苯和壬烷也具有抑制黄曲霉菌的作用。其中2,4-二甲基噁唑和2-十二烷醇为首次报道对病原真菌具有抑制作用。丰度最高、抑菌活性最强的二甲基三硫,在YM8菌株的抑菌活性中具有重要作用;3.产气菌对粮食中黄曲霉抑菌效率分析。将YM8菌与接种黄曲霉孢子的花生、玉米籽粒共培养后检测结果表明,对照组样品中水活度越高发病率越高,毒素含量越大。高水活度下花生样品发病率为100%,毒素含量为54μg/g,玉米样品发病率为100%,毒素量为5.59μg/g,与此相比,YM8菌株可完全抑制花生、玉米籽粒黄曲霉菌生长和毒素合成,在3种水活度下的黄曲霉菌与产毒量均为0。扫描电子显微镜观察,未经YM8处理的花生,表面覆盖大量黄曲霉菌丝和孢子;而YM8处理组的花生表面,孢子不能萌发,没有菌丝及产孢结构,少量异常孢子形状畸形,表面干瘪皱缩,失去侵染和萌发能力;4.YM8序列测定及BAC文库构建。YM8全基因组测序结果表明,该菌株基因组大小为4-5 M bp;提取YM8菌株DNA构建大肠杆菌BAC文库,获得含有1152个克隆(片段长度为60 kb左右)的BAC文库用于后续克隆二甲基三硫编码基因。YM8菌株在基础培养基中抑菌作用较弱,通过在基础培养基中添加不同氨基酸,发现甲硫氨酸和半胱氨酸能显著提高抑菌活性,说明这2种含硫氨基酸为合成二甲基三硫的关键物质,可能参与二甲基三硫的代谢合成途径。