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目的:肝肺综合症(hepatopulmonary syndrome,HPS)是指在肝硬化或门脉高压基础上发生的呼吸功能障碍,通常包括肝硬化、肺内血管扩张和动脉低氧血症三联症。肺内毛细血管弥漫性扩张是HPS的基本病理改变,其发生与扩血管物质一氧化氮(nitric oxide,NO)异常增多密切相关。NO是肺血管扩张的重要介质,同时能够刺激血管内皮细胞增生和毛细血管向周围组织生长,致使肺泡间隔增宽和肺泡容量减小,最终导致PaO2下降、P(A-a)O2增大。NO由一氧化氮合酶(nitricoxide synthase,NOS)催化L-精氨酸生成。目前认为HPS时,内皮素(endothelin,ET)通过与内皮上ETB受体结合使内皮型NOS(endothelial NOS, eNOS)活化,促进NO合成;而血管内的巨噬细胞活化或聚集可以引起诱导型NOS(inducible NOS, iNOS)增加,促进NO合成。磷脂酰肌醇-3激酶( phosphatidylinositol 3 kinase , PI3K )家族是一类特异性地催化磷酯酰肌醇(phosphatidylinositol, PI) 3位羟基磷酸化,并产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶。PI3K是由两部分组成的异源性二聚体,包括调节亚单位p85和催化亚单位p110。p85亚单位包含两个SH2功能域和一个SH3功能域。当细胞被生长因子刺激后,p85亚单位的SH2功能域与酪氨酸磷酸化受体或连接蛋白结合,进而将p85·p110复合体结合于细胞膜内侧以转导信息。Akt又称蛋白激酶B( protein kinase B, PKB),是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在细胞内信号转导系统中位于PI3K的下游,是癌基因v-akt编码产物的同系物。目前发现至少存在3种Akt家族成员: Aktl/PKBα、Akt2/PKBβ、Akt3/PKBγ,尽管它们由不同基因编码产生,但是它们密切相关,相互间同源性> 80 %,但在不同组织中的表达各不相同。Akt主要通过依赖PI3K方式活化。其活化都依靠两个位点的磷酸化:一个是活性区的Thr308位点,另一个是羧基端疏水区Ser473。只有当两个位点全部磷酸化后,Akt才能够完全被激活。活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游一系列底物如NF-κB、Bad、caspase9和GSK-3等改变,从而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移。研究发现,细菌易位(bacterial translocation,BT)之所以与HPS发生有关,归因于超量生产的TNF-α。有研究报道,在HPS模型中,血液单核细胞可在肺血管内黏附、聚积,并于肺血管内皮分化成肺血管内巨噬细胞( pulmonary intravascular macrophages, PIM) ,PIM可被内毒素(LPS)活化,导致大量细胞因子如TNF-α、NO、IL-1、IL-6和IL-8等炎症介质释放入血液。其中,TNF-α是具有代表性的炎性介质,能够诱导局部释放单核细胞趋化因子,并刺激巨噬细胞和内皮细胞表达粘附因子,进一步加剧肺血管内巨噬细胞的大量聚集、粘附。TNF-α还能够以依赖PI3K/Akt信号通路的方式进一步激活NF-κB,活化的NF-κB参与了包括iNOS和TNF-α在内的众多炎症因子的转录。其结果是:一方面,巨噬细胞内iNOS过度表达,导致NO的过度生成;另一方面,新生成的TNF-α则又能进一步增强NF-κB的作用,形成级联正反馈。最终使NO过量生成,导致HPS的发生。HPS在肝硬化中发病率为10～20%,预后不良。目前由于HPS的发病机理仍然未明,故药物治疗的效果并不满意。目前,仅肝移植是唯一肯定有效的治疗HPS方法。所以,研究HPS的肝肺综合征发病机制,寻找有效的治疗方法至关重要。由于近年来TNF-α单克隆抗体用于治疗Crohn’s病、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎等疾病取得了良好效果,所以我们推断应用TNF-αMcAb阻断TNF-α效应,对HPS的治疗应该有一定价值。而且,目前还没有关于应用TNF-αMcAb治疗HPS的研究,为此,我们采用多种实验方法,应用TNF-αMcAb治疗胆总管结扎(common bile duct ligation, CBDL)致肝肺综合征大鼠,观察TNF-αMcAb干预后对PI3K和Akt表达的影响,讨论TNF-αMcAb对HPS治疗作用,以及HPS的发生过程中的信号转导机制。方法:采用胆总管结扎CBDL致大鼠肝肺综合征模型。将60只雄性Sprague Dawley大鼠随机分为假手术组(sham组)、胆总管结扎组(CBDL组,分为胆总管结扎1周、2周、3周、4周、5周组五个亚组)及胆总管结扎+TNF-αMcAb干预组(CBDL+TNF-αMcAb,分为胆总管结扎1周后TNF-αMcAb治疗1周、2周、3周、4周组四个亚组),共10个亚组,每组各6只雄性SD大鼠。干预组与术后1周开始腹腔内注射TNF-αMcAb(0.1g/kg/2d), CBDL组对应注射相当剂量的生理盐水。各组动物在规定时间取材(sham组和CBDL组第五周动物同时取材),取静脉血测肝功能,TNF-α和NO的含量;取动脉血测定肺泡-动脉氧分压差(P(A-a)O2);取肝、肺组织进行HE染色和Masson三色观察以确定模型建立情况,肝硬化形成情况及不同组间的病理学变化差异;采用免疫组织化学法(SP法)检测PI3K、p-Akt在肺组织中的表达定位及表达程度;应用RT-PCR和Western blot方法分别检测PI3K、Akt在肺组织中mRNA和蛋白的表达。结果:1肝脏及肺脏病理改变1.1肝脏病理(HE及Masson染色):sham组大鼠肝小叶结构完整,肝板排列整齐,仅在门管区可见少量结缔组织。CBDL组大鼠肝脏小胆管广泛增生,胆管扩张,纤维组织增生,假小叶形成。TNF-αMcAb组大鼠肝脏小叶结构变化不明显,小胆管仍有增生,门管区胶原纤维轻微增多,未见假小叶形成。1.2肺脏病理(HE染色):sham组大鼠肺脏毛细血管形态正常,肺泡壁薄厚一致,肺泡腔规则。CBDL组大鼠肺脏大鼠肺泡毛细血管增生、扩张,伴肺泡间隔增宽、容量减小,可见巨噬细胞。TNF-αMcAb组大鼠肺脏毛细血管轻度扩张,肺泡间隔轻度增宽。2肝功能检测:血浆ALT在CBDL术后造模组1周(177.00±56.32 U/L)较sham组(56.33±9.29 U/L)明显增加,有统计学意义(P<0.05)。之后逐渐下降,但均明显高于sham组(P<0.05)。TNF-αMcAb组干预2周即较同周CBDL组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),之后,呈下降趋势,至治疗4周(63.00±7.55 U/L)时与CBDL组(87.67±17.50 U/L)比较差异明显(P<0.05),虽仍高于sham组,但是差异无统计学意义(P>0.05)。3血浆TNF-α检测:CBDL术后1周血浆TNF-α水平(1.60±0.07 ng/ml)即明显升高,之后呈上升趋势,3周时血浆TNF-α水平(3.18±0.54 ng/ml)达高峰,4周时有所回落,5周又稍有回升,但均明显高于sham组(0.75±0.14 ng/ml)(P<0.05),差异有统计学意义。TNF-αMcAb干预治疗后1周即开始明显降低,之后继续下降,至干预治疗后4周(1.21±0.13 ng/ml)与CBDL组比较(2.43±0.43)明显降低((P<0.05),虽仍高于sham组,但差异无统计学意义(P>0.05)。4动脉血气分析检测:CBDL造模2周时P(A-a)O2(17.65±2.67 mmHg)开始增大,之后呈上升趋势,5周时达到(51.67±8.49 mmHg),明显高于sham组(6.70±3.20 mmHg),有统计学意义(P<0.05)。TNF-αMcAb干预治疗后2周较CBDL术后同周组开始下降,之后呈下降趋势,至治疗4周(10.5±8.51 mmHg)的P(A-a)O2与同周CBDL组(51.8±8.49 mmHg)比较,有明显差异(P<0.05)。虽仍高于sham组,但是差异无统计学意义(P>0.05)。5 NO检测结果:CBDL术后1周NO开始上升,与sham组比较有明显差异(P<0.05)。至3周末(95.67±15.41 umol/l)达到高峰后,之后呈下降趋势,但均明显高于sham组(36.19±1.59 umol/l)。TNF-αMcAb干预治疗后1周NO的量即开始明显低于同周CBDL组(74.38±2.67)水平,有统计学意义(P<0.05),之后继续下降,至干预治疗后3周(45.47±9.58 umol/l)、4周(44.42±9.27 umol/l)与CBDL组3周(72.22±6.11 umol/l)和4周(64.31±1.75 umol/l)比较差异明显,虽仍高于sham组,但已无明显差异(P>0.05)。6肺组织PI3K的表达6.1 RT-PCR扩增检测: PI3K mRNA的表达在CBDL组的第二周即达一个高峰(1.75±0.15),此后在第三周出现一个低谷(1.07±0.19),随后又上升至(1.26±0.16),第五周又降低至(0.98±0.11),但均高于sham组(0.28±0.08),差异有统计学意义(P<0.05)。TNF-αMcAb干预治疗组在干预一周(0.34±0.14)开始有明显的抑制,差异具有统计学意义(P<0.05),随后呈逐渐上升趋势,但是均较同时间点的CBDL组表达低,差异明显(P<0.05)。干预四周后与sham组比较,差异仍有统计学意义(P<0.05)。6.2免疫组织化学检结果显示,①CBDL组:大鼠肺组织内PI3K蛋白的阳性表达较多,可见细胞胞浆呈棕褐色细颗粒,阳性表达多集中在肺内巨噬细胞胞浆中,于二周时达高峰(0.31±0.10),此后,CBDL组在三周时有短暂的下降,四周、五周又见回升,表达均高于sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。②TNF-αMcAb组:干预治疗一周(0.19±0.03)后,与CBDL相比,PI3K蛋白表达即被明显抑制(P<0.05),此后,在各时间点的阳性表达均比同时间点的CBDL组弱,基本维持在上述的水平,但是仍明显高于sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。6.3 Western Blot分析: PI3K在85KD的位置出现杂交带。蛋白表达变化趋势同上述免疫组化检测结果。7肺组织Akt和p-Akt的表达7.1 RT-PCR扩增检测:①CBDL组Akt mRNA的表达呈逐渐升高的趋势,至第三周达峰值(2.07±0.18),与sham(0.58±0.06)组比较存在明显差异(P<0.05),随后呈下降趋势,但仍高于sham组。②TNF-αMcAb干预治疗组Akt mRNA的表达趋势与CBDL组基本一致,在治疗的前三周与相应的CBDL组比较,其表达即被明显抑制,表达较少,干预二周时差异性即具有统计学意义(P<0.05),但随着CBDL组的表达的逐渐减少,至第四周(0.64±0.06)与CBDL组比较无明显差异(P>0.05),但是与sham组的差异仍明显(P<0.05)。7.2免疫组织化学分析p-Akt:p-Akt蛋白的阳性反应为黄色颗粒,主要定位在肺巨噬细胞的胞浆。①CBDL组p-Akt蛋白阳性表达在术后四周达峰值(0.31±0.03),与sham组(0.09±0.03),阳性细胞数目和表达强度均较高,差异有统计学意义(P<0.05)。②TNF-αMcAb干预治疗组各时间点的蛋白的阳性表达较CBDL组均有明显的减少,至治疗的第四周(0.20±0.03)明显低于同周CBDL组(0.28±0.03),差异有统计学意义(P<0.05),仍高于sham组,差异有统计学意义(P<0.05)。7.3 Western Blot分析Akt:①CBDL组Akt蛋白表达呈逐渐上升的趋势,于术后第三周达一个高峰值(2.45±0.23),此后下降到(1.74±0.18),五周时稍有回升(1.92±0.10),均高于sham(1.08±0.20),差异有统计学意义(P<0.05)。②TNF-αMcAb组治疗1周(1.79±0.04)后与同时间的CBDL组相比较,即被明显的抑制,此后一直在此水平波动,前三周一直明显低于手术组,但是第四周(1.80±0.21)较CBDL组(1.92±0.10)比较差异不明显(P>0.05),但是仍高于sham组,差异亦有统计学意义(P<0.05)。7.4 Western Blot分析p-Akt:p-Akt蛋白表达结果与免疫组化结果一致。8血浆中TNF-α和NO的相关性分析相关系数r为0.719,相关系数的概率值为P =0.005<0.05,差异有统计学意义,说明肝肺综合征大鼠的血浆中TNF-α水平与NO水平有相关关系,并且为正相关,即随着血浆TNF-α的增加NO的水平也增加。结论:1 HPS的形成和发展过程中,肝脏功能的改变是肺功能变化的基础;2 TNF-α可能是HPS的发生、发展过程中一个重要的因子;3 HPS的发生过程中伴随PI3K、Akt表达明显增加,p-Akt的水平升高,存在PI3K/Akt信号转导通路的活化,说明PI3K/Akt的信号转导与HPS发生有关;4 TNF-αMcAb可特异性结合血浆中的TNF-α,从而降低血浆中TNF-α水平,一定程度上抑制PI3K、Akt蛋白的表达和激活,使NO释放减少,改善了HPS严重程度。