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肠系膜血管病变容易引起小肠缺血或坏死,继而一次或多次手术最终导致短肠综合征(short bowel syndrome,SBS)的发生。缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)是肠道缺血后再灌注反而加重损伤的过程,参与到肠系膜血管病导致SBS的发病机制中。自噬(autophagy)是普通存在于原核和真核生物的以细胞自我吞噬为主要机制的一种保守现象。在饥饿或者外界压力的刺激下,细胞自噬可以被诱发,因此IRI在一定条件下同样可以诱发自噬的发生。本课题研究的主要目的即是通过在动物体内模仿由于肠系膜血管病变导致SBS的临床过程,进而研究肠切除术后不同时间点自噬和凋亡的表达以及胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptide-2,GLP-2)治疗肠切除术后肠适应(intestinal adaption)过程的分子机制和通过自噬和凋亡表达变化探讨肠切除术后早期开始给予GLP-2治疗的最佳时间。第一部分肠切除术后剩余肠管自噬和凋亡的表达1.研究目的本部分实验主要研究与假手术相比,肠切除术后不同时间点自噬和凋亡的表达情况。2.研究方法(1)通过动物实验分组分别建立假手术,单纯MBR以及IRI合并MBR的动物模型;(2)联合电子显微镜(electron microscopy,EM),聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和Western Blotting等多种实验方法以及多种自噬标志物包括LC3,P62,Atg5和Beclin-1以检测自噬在肠切除术后不同时间点的表达;(3)通过Western印迹法检测肠切除术后不同时间点凋亡相关蛋白二磷酸腺苷核糖多聚酶(Poly Adenosine Diphosphate Ribose Polymerase,PARP)和Caspase 8的表达。3.研究结果(1)电镜结果显示肠切除术后24小时内,肠切除术后肠组织中观察到的自噬体的数量显著增加,肠切除术后72小时自噬体的数量明显减少;(2)与假手术相比,在m RNA水平上自噬标志物LC3,Atg5以及Beclin-1的表达在肠切除术后24小时内均显著增高,72小时上述标志物的表达则明显减少。与此同时P62的表达在肠切除术后24小时内显著减少,各组间均有统计学差异(p<0.01);(3)在蛋白水平上,结果显示肠切除术后24小时内LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化率以及LC3Ⅱ的表达最为显著,同时Atg5和beclin-1的表达亦明显增加,72小时上述标志物的蛋白表达则明显减少。P62的表达在肠切除术后24小时内显著降低,而72小时则明显增加,各组间均有统计学差异(p<0.001);(4)凋亡相关蛋白PARP和Caspase8在肠切除术后24小时无明显变化,而在72小时和7天则显著增加,各组间均有统计学差异(p<0.001)。4.小结与假手术相比,肠切除术后8小时,16小时和24小时,自噬无论在m RNA还是在蛋白水平上的表达均有明显增高,IRI合并MBR后自噬标志物的表达增高更为显著。与此同时凋亡相关蛋白的表达在肠切除术后24小时并未有明显增高。肠切除术后72小时自噬的表达较前有所降低,而凋亡相关蛋白的表达则显著增高,肠切除术后7天凋亡的表达趋于稳定。由此可以得出肠切除术后24小时内自噬过度表达,可能启动类似于凋亡的自噬性细胞死亡,同时可以拮抗凋亡的作用。肠切除术后72小时自噬的表达逐渐降低进而主要发挥对肠道组织保护性的机制,与此同时凋亡的表达则逐渐增加,从而刺激肠道粘膜的自我更新,促进肠切除术后肠适应的进程。第二部分自噬参与胰高血糖素样肽-2治疗肠切除术后肠适应过程的分子机制1.研究目的本部分实验主要验证与给予生理盐水治疗相比,肠切除术后不同时间点给予GLP-2治疗后,可能通过Akt-m TOR信号通路调节自噬的表达进而参与到肠切除术后肠适应过程中。同时还验证GLP-2治疗后对肠切除术后肠道粘膜损伤的保护作用。2.研究方法(1)在第一部分动物模型的基础上,肠切除术后不同时间点分别开始连续3天分别给予腹腔注射同等剂量的GLP-2和生理盐水;(2)免疫组化(immnohistochemistry,IHC)检测肠切除术后不同时间点给予GLP-2治疗后GLP-2受体的表达情况;(3)Western Blotting检测肠切除术后不同时间点治疗后Akt-m TOR信号通路中Akt,m TOR和4EBP1分子的表达情况;(4)酶联免疫吸附反应(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和苏木精-伊红染色(hematoxylineosin staining,HE)分别检测肠切除术后不同时间点给予GLP-2治疗后肠道中炎症因子乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)的表达和肠道粘膜损伤的评估。3.研究结果(1)IHC结果显示肠切除术后24小时给予GLP-2治疗后GLP-2R表达显著增加,72小时治疗后则表达明显减少,各组间均有统计学差异(p<0.001);(2)Western结果显示与对照组相比,肠切除术后16小时给予GLP-2治疗后信号通路相关分子Akt,m TOR及4EBP-1的表达开始显著增加,24小时治疗后相关分子表达达到峰值,而72小时治疗后表达则有所降低,各组间均有统计学差异(p<0.001);(3)ELISA结果显示肠切除术后给予GLP-2治疗后LDH的表达均有所降低,但是无明显统计学差异(p=0.282);(4)病理切片染色结果显示肠切除术后给予GLP-2治疗后肠道粘膜损伤评分明显降低,尤以24小时治疗时效果最为显著,各组间均有统计学差异(p<0.001)。4.小结总的来说,与对照组相比,肠切除术后24小时给予GLP-2治疗后可通过与高表达的GLP-2R结合后激活Akt-m TOR信号通路,进而调控自噬的表达参与到肠切除术后肠适应的过程中。但是推测在治疗后的肠适应的过程中可能还有PI3K-beclin-1等其它自噬相关信号通路的参与。与此同时,肠切除术后给予GLP-2治疗后肠道粘膜的炎症反应无明显差异但对肠道粘膜损伤有显著保护作用。第三部分通过自噬和凋亡的表达变化探讨肠切除术后早期给予GLP-2治疗的最佳时间1.研究目的本部分实验主要与生理盐水治疗相比,通过肠切除术后不同时间点给予GLP-2治疗后自噬和凋亡的表达情况来进一步探讨肠切除术后早期给予GLP-2肠康复治疗的最佳时间。2.研究方法(1)动物模型同第二部分;(2)除了第一部分自噬和凋亡的检测方法以外还使用IHC和末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)分别检测自噬和凋亡的表达情况。3.研究结果(1)电镜结果显示肠切除术后24小时内给予GLP-2治疗后自噬体数量减少最为显著,72小时治疗后自噬体数量有所增加;(2)在m RNA水平上,肠切除术后24小时内给予GLP-2治疗后自噬标志物LC3,Atg5,beclin-1表达显著降低,尤其以24小时治疗后最为明显,与此同时P62的表达在治疗后明显增加,各组间均有统计学差异(p<0.001);(3)Western的结果表明肠切除术后24小时给予GLP-2治疗后LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化率及LC3Ⅱ的表达明显降低,同时Atg5,Beclin-1的表达也在治疗后被明显抑制,而P62的表达则在治疗后显著增加。72小时治疗后自噬相关蛋白的表达显著增加,各组间均有统计学差异(p<0.001);(4)凋亡相关蛋白PARP和Caspase 8在肠切除术后24小时内给予GLP-2治疗后无明显变化,肠切除术后72小时治疗后凋亡的表达明显受抑制,7天治疗后凋亡的表达有所增加,各组间均有统计学差异(p<0.001);(5)IHC的结果显示肠切除术后24小时治疗后LC3,Atg5以及Beclin-1表达明显减少,而P62表达明显增加,72小时治疗后LC3,Atg5以及Beclin-1表达明显增加,而P62表达明显减少,各组间均有统计学差异(p<0.01);(6)TUNEL的结果显示肠切除术后24小时治疗后凋亡小体的数量无明显变化,而72小时治疗后凋亡小体的数量明显减少,7天治疗后其数量显著增加,各组间均有统计学差异(p<0.001)。4.小结肠切除术后8小时和16小时给予GLP-2治疗后自噬和凋亡表达变化均不明显而24小时治疗后自噬的表达明显受抑制,但凋亡的表达变化并不明显。肠切除术后72小时治疗后自噬的表达显著增加,而治疗后凋亡的表达明显受抑制。总而言之,通过肠切除术后不同时间点给予GLP-2治疗后自噬和凋亡表达的变化情况可以推测肠切除术后24小时是早期开始给予GLP-2肠康复治疗的最佳时间,长期治疗效果仍有待进一步的研究。