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目的:基因甲基化状态改变是肿瘤获得性耐药产生的重要途径之一。DNMT1、DNMT3a是基因甲基化的重要调节因子。多项研究表明DNMT1、DNMT3a的异常表达可能影响肿瘤对化疗药的敏感性。因此本研究计划通过外源性表达质粒转染技术上调DNMT1、DNMT3a在顺铂敏感细胞株A549中的表达,以及利用小发卡RNA干扰技术下调DNMT1、DNMT3a在耐顺铂细胞株A549-DDP细胞中的表达,探究DNMT1、DNMT3a表达的改变与肺腺癌细胞对顺铂化疗敏感性的关系,为进一步阐明非小细胞肺癌(NSCLC)对顺铂耐受的机制,寻找预测NSCLC对顺铂化疗耐受的标志及肺癌的个体化治疗提供理论依据。 方法:LZRS-DNMT1、pcDNA3/Myc-DNMT3a分别转染A549细胞并利用RT-PCR和Western-blot检测转染前后DNMT1、DNMT3a在mRNA和蛋白水平的改变,甲基化特异性PCR检测转染后DNMT1、DNMT3a下游基因RASSF1A启动子甲基化状态的改变,并用 Western-blot检测RASSF1A在蛋白水平表达的改变;0-10μmol/L六个不同浓度顺铂作用转染前后细胞24h,MTT法检测转染前后细胞活力变化及计算IC50;用不同浓度顺铂(0、2.5、5μmol/L)处理5d后,结晶紫染色计算转染前后细胞克隆形成数;2.5μmol/L顺铂处理24h,然后通过流式细胞仪来检测细胞转染前后凋亡分数的改变情况。 构建携带干扰DNMT1、DNMT3a保守序列基因表达的RNAi序列的重组小发卡RNA干扰质粒pGenesil-1-DNMT1-shRNA、pGenesil-1-DNMT3a-shRNA,然后分别转染A549-DDP细胞,利用RT-PCR技术、Western-blot技术检测转染24h、48h、72h后DNMT1、DNMT3a在mRNA和蛋白表达水平的变化;分别用0-80μmol/L梯度浓度的顺铂作用24h后,MTT法用于检测转染前后细胞活力变化及计算IC50;用不同浓度顺铂(0、25、50μmol/L)处理5d后,结晶紫染色计算转染前后细胞克隆形成数;经过25μmol/L顺铂处理24h后,流式细胞仪检测质粒转染前后细胞凋亡分数的改变。 结果:LZRS-DNMT1、pcDNA3/Myc-DNMT3a转染A549细胞后,DNMT1、DNMT3a在mRNA和蛋白水平均明显高于未转染组,MSP证实转染后RASSF1A启动子均发生了甲基化,而对照组未发生甲基化,转染后RASSF1A蛋白表达明显低于未转染组;转染后细胞对顺铂的IC50明显高于A549细胞[(9.14±0.59)μmol/L vs(5.49±1.00)μmol/L,P=0.001;(9.19±0.91)μmol/L vs(4.96±0.58)μmol/L,P=0.000];不同浓度顺铂连续作用5天后,转染后细胞克隆形成数均明显高于A549细胞组;2.5μmol/L顺铂作用24h后,转染后细胞凋亡率明显低于未转染细胞[(2.24±0.36)% vs(4.43±1.03)%,P=0.036;(1.33±0.38)%vs(5.22±0.67)%,P=0.039]。 pGenesil-1-DNMT1-shRNA、pGenesil-1-DNMT3a-shRNA转染A549-DDP细胞后,DNMT1、DNMT3a表达明显低于未转染组,细胞对顺铂的IC50明显低于未转染细胞[(46.13±5.15)μmol/L vs(64.79±12.96)μmol/L, P=0.004;(46.63±7.48)μmol/L vs(67.50±13.80)μmol/L,P=0.001];不同浓度顺铂连续作用5天后,转染干扰质粒细胞的克隆形成数均明显低于A549-DDP细胞组,25μmol/L顺铂作用24h后,转染后的细胞凋亡率明显高于未转染细胞[(21.99±5.80)%vs(10.95±1.51)%,P=0.033;(21.44±3.81)%vs(10.95±1.51)%,P=0.02]。 结论:DNMT1、DNMT3a表达异常可能是肺腺癌细胞对顺铂获得性耐药的重要原因之一,非小细胞肺癌患者DNMT1、DNMT3a表达水平改变是否可作为临床预测肺癌患者对顺铂敏感性降低的生物标志值得进一步研究。