水母是一类生物总量庞大的海洋浮游动物。水母触手上密布刺丝囊，当触及人体或动物体时，发射刺丝进行袭击，同时释放出毒液。研究表明，水母毒素主要属蛋白质与多肽类，毒性大，活性高。研究水母毒素发挥多种强效应作用的物质基础，可为阐明水母毒素的组成、作用机制及充分利用其有效成分奠定基础。　　 毒素蛋白具有热不稳定性，组分较复杂等，传统分离方法在纯化水母毒素蛋白方面效率不高。目前国内外对单一水母毒素蛋白的序列报道较少，对其组成、结构还没有全面深入的了解。因此，为全面筛选与水母毒素生物学活性密切相关的功能基因，前期我们选择我国东南近海常见的有毒水母——发形霞水母（Cyanea capillata），利用SMART技术构建了其触手组织cDNA文库。通过大规模随机测序和同源比较，发现其中有三条EST序列所编码的氨基酸序列与虾红素样金属蛋白酶家族(astacin-likemetalloproteases)高度同源，提示该三条序列所编码的蛋白均属虾红素样金属蛋白酶。　　 金属蛋白酶类已被证实存在于蛇类等有毒动物的毒液中，作为毒素组分发挥重要作用。Hyunkyoung Lee等发现Nemopilema nomurai等四种水母的刺丝囊毒素具有降解明胶、酪蛋白和纤维蛋白的活性，用广谱金属蛋白酶抑制剂处理后大部分活性消失，表明它们主要属于金属蛋白酶类[1]，首次证明了水母毒素中存在大量金属蛋白酶。虾红素样金属蛋白酶是一种典型的锌依赖内肽酶，有很强的蛋白水解活性。研究发现，虾红素样金属蛋白酶能降解细胞外基质组分，引起出血等，这与水母毒素的部分生物学活性相一致。近期也有研究发现，褐色蜘蛛(genus Loxosceles)毒液中存在一个虾红素样金属蛋白酶基因家族，能降解胞外基质组分，协助其他毒素成分扩散，可能作为毒素组分发挥生物学功能[2]。结合文献报道，我们推测，触手cDNA文库中发现的虾红素样金属蛋白酶家族很可能在水母毒素发挥毒性效应中具有重要作用。对该基因家族进行深入研究，将有助于阐明水母毒素生物学活性的物质基础及其作用机制。　　 本课题以C.capillata触手cDNA文库中发现的三条虾红素样金属蛋白酶的编码序列为基础，分别将其命名为CALP1((C)yanea capillata(a)stacin-(l)ike metallo(p)roteases1)，CALP2和CALP3。利用生物信息学等方法对其序列进行了全面分析，构建CALP原核重组表达质粒，摸索最佳诱导表达条件后进行融合蛋白的诱导表达、纯化，进一步对其活性和功能进行研究。　　 一、CALP基因家族全长序列的特征分析　　 我们通过NCBI在线软件确认CALP基因家族三条序列均具有完整的开放阅读框。进一步利用BLAST比对后获得了其全长cDNA序列。分析显示，CALP1、CALP2和CALP3均包含一个典型的虾红素样结构域，含有两个特征序列:Zn结合基序HEXXHXXGFXHEXXRXDRD和Met旋转SXMHY，提示它们同属虾红素样金属蛋白酶家族。CALP1、CALP2和CALP3分别含有304、313和333个氨基酸残基，分子量约为35 kDa、35 kDa和38 kDa，均属于碱性蛋白。CALP2和CALP3含有信号肽，为分泌蛋白;CALP1不含信号肽，定位于胞质。三个分子均不含跨膜结构域，但有多个磷酸化、糖基化位点和二硫键，富含亲水区域，疏水区较少。除虾红素样结构域外，CALP1和CALP3在C端还含有两个ShK毒素结构域。ShK结构域能阻断K+通道，调节膜电位，通过阻断钾通道的K+外流促进Ca2+内流[3]，引起胞内Ca2+超载而损伤细胞[4-6]。这提示该两个分子除蛋白水解作用外，还可能在毒素发挥毒性效应中具有其他方面作用。　　 二、CALP基因家族的重组克隆与融合蛋白的小量表达　　 根据CALP1、CALP2和CALP3的完整编码区（CALP1去除前肽部分，CALP2和CALP3去除前肽和信号肽部分）序列设计引物，利用pET24a原核表达质粒构建了CALP1、CALP2和CALP3完整编码区C端带有6*His标签的重组表达载体，经酶切和DNA测序鉴定正确。将构建成功的重组质粒转入E.coli Rosetta(DE3)表达菌中，在1 mM IPTG，37℃，250 rpm条件下小量诱导表达融合蛋白。SDS-PAGE电泳检测显示，CALP1、CALP2和CALP3分别在33 kDa、26 kDa和32 kDa有目标蛋白条带。进一步使用6*His标签抗体对诱导表达的融合蛋白进行鉴定，Western Blot结果显示，在全菌裂解液中分别可检测到单一特异性条带，分子量分别为33 kDa、26 kDa和32 kDa，与根据序列预测得到的目标蛋白分子量大小相一致。　　 三、CALP融合蛋白的大量表达、纯化及其生物学功能研究　　 1、CALP融合蛋白最佳诱导表达条件的摸索与优化　　 为获得大量且具有生物学活性的重组融合蛋白，在小量诱导表达的基础上，我们进一步对CALP融合蛋白的诱导表达条件进行了摸索和优化。首先对蛋白可溶性表达的最佳诱导条件进行了摸索。实验结果显示，Rosetta菌株比BL21(DE3)菌株更有利于CALP融合蛋白的表达，但CALP1和CALP2的表达量相对较低，CALP3则不能可溶表达。这可能与虾红素样金属蛋白酶含有较多的二硫键和结构修饰位点有关，导致其空间结构在大肠杆菌中很难正确折叠。由于可溶性表达的融合蛋白表达量不高且易形成包涵体，我们进一步对CALP融合蛋白包涵体表达的最佳条件进行了分析。结果显示，在各目标融合蛋白的最优表达条件下，大部分蛋白以包涵体的形式存在于表达菌裂解液的沉淀中。CALP1和CALP2的包涵体表达量较高，CALP3表达量相对较低。对包涵体进行洗涤，利用筛选出的最佳溶解力的溶解液进行溶解。利用HisTrap HP凝胶亲和层析纯化重组蛋白.Western blot检测结果显示，CALP1、CALP2和CALP3的分子量分别约为33 kDa、26 kDa和32 kDa，与根据序列预测得到的目标蛋白分子量大小相一致。进一步使用化学稀释法和物理透析法对融合蛋白进行了复性。　　 2、C.capillata刺丝囊毒素及CALP融合蛋白的蛋白水解活性检测　　 我们选择明胶、纤连蛋白和纤维蛋白原作为底物，分别检测C.capillata刺丝囊毒素、触手提取物及CALP融合蛋白的蛋白水解活性。明胶降解法的结果显示，刺丝囊毒素在95 kD和72 kD之间有一条明显白色条带，在170 kD有一条较淡条带，抑制剂1，10-二氮菲作用后，条带明显减弱。表明刺丝囊毒素具有降解明胶的作用。C.capillata刺丝囊毒素对纤连蛋白、纤维蛋白原也表现出明显的蛋白水解活性，且蛋白水解作用也可被抑制剂显著抑制。C.capillata触手提取物对明胶、纤连蛋白和纤维蛋白原也具有降解作用，但活性弱于刺丝囊毒素。我们进一步检测了C.capillata触手提取物对贴壁细胞形态变化的影响。结果表明，TE作用于肾小管上皮细胞1h后，与正常对照组相比，TE处理组细胞变圆，细胞间隙明显变大，细胞从培养板底部脱离。表明C.capillata触手提取物能降解胞外基质组分，这也与文献报道的水母毒素胞外基质降解作用相一致。　　 我们采用五种复性方案对纯化的CALP融合蛋白进行复性，检测其蛋白水解活性。结果显示，复性后的CALP融合蛋白的蛋白水解活性较弱。明胶降解检测时，CALP1和CALP3在95 kD和72 kD之间有一条微弱的白色条带，与NV的蛋白降解条带位置一致，但活性较弱。CALP2活性不明显。这可能是由于包涵体复性条件不佳，或因为CALP含有较多的二硫键和结构修饰位点，蛋白空间结构很难正确折叠。我们也拟进一步使用毕赤酵母真核表达系统对CALP融合蛋白进行表达，验证其蛋白水解活性和对胞外基质的降解作用，最终阐明CALP家族在水母毒素发挥毒性效应中的功能。　　 综上所述，我们通过大规模测序和同源分析，从C.capillata触手cDNA文库中发现了虾红素样金属蛋白酶CALP基因家族。该家族的三个成员在序列上与虾红素样金属蛋白酶具有高度同源性，含有保守的虾红素样结构域。成功构建了pET24a-CALP1、pET24a-CALP2和pET24a-CALP3原核重组表达载体，并在E.coliRosetta(DE3)中诱导表达了融合蛋白，摸索分析了CALP可溶表达及包涵体表达的最优条件。纯化后使用多种方法对包涵体进行溶解和复性处理。蛋白水解检测结果显示，C.capillata刺丝囊毒素及其触手提取物均具有明显的明胶、纤维蛋白原和纤连蛋白降解活性，但复性后的融合蛋白水解活性相对较低，还需进一步采用真核表达系统对其活性与功能进行验证和深入研究。