癫痫(Epilepsy)是一种以短暂的脑功能失常为特征的慢性脑部疾病，其发病率为世界人口总数的0.5-1％。癫痫的发病机制很复杂，至今仍未完全阐明。近年研究发现诱发癫痫发病的主要因素除了与神经元兴奋性异常增高有关，还与机体自身缺乏有效的抑制性神经信息传递有密切的联系[1,2]。神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)是由36个氨基酸构成的一种活性多肽。由Tatemoto等[3]于1982年首次从猪脑中提取，分子量约为4.2KD，广泛分布在哺乳动物中枢神经系统中。NPY已经被证实与癫痫等某些人类神经疾病有关。作为机体内重要的内源性调控兴奋性神经递质传递的神经肽，NPY主要由能同时表达GABA的中间神经元产生，且在海马结构中的浓度最高[4]。NPY能够参与调控各种离子通道的功能，例如抑制由钾电流引发的谷氨酸释放[5]。还有学者认为NPY介导的突触前抑制作用则可能与选择性调控N型电压门控性钙离子通道(VGCC)有关[6]。　　目前发现，NPY可能与癫痫的发生发展相关。有研究者发现利用电刺激诱导大鼠癫痫发作时，海马神经元NPY表达量持续上升，同时在齿状颗粒细胞以及皮质也观察到NPY的大量表达[7]。而将外源性NPY通过侧脑室注入红藻氨酸致痫大鼠，中能抑制运动性癫痫的发作，并能大幅度缩短齿状回和CA3区记录到的癫痫样脑电。说明NPY不仅作为一种内源性的神经保护物质能够抵御癫痫，外源性注射NPY也能够缓解癫痫症状。由于NPY释放后通过与细胞膜上的NPY受体结合发挥其生物学功能。因此不同的NPY受体表达变化对癫痫发病的影响也可能有所差异。　　NPY受体属于G蛋白耦联受体家族成员。目前已经发现8种NPY受体亚型，分别命名为Y1-Y8[8]。在哺乳动物中枢神经系统，特别是在海马和皮质等与癫痫发生密切相关的部位，Y1、 Y2和Y5三种受体亚型的表达最为丰富。NPY受体活化后通常与抑制性G蛋白(Gi)耦联而抑制腺苷酸环化酶活性，最终动员或者抑制钙离子的释放，此外还可通过影响相关离子通道的表达以激活蛋白激酶C传递不同的调控信息[9]。在不同的癫痫模型中，Y1、Y2和Y5受体的表达变化以及功能存在一定差别。近年来，人工过表达NPY及其特异受体成为癫痫基因治疗的新热点[10，11，12]。这种基因治疗方法通过人工合成含有高表达NPY或NPY受体基因的质粒并转染到细胞或动物模型中。但是在不同的癫痫模型中，参与基因治疗的NPY及其受体也会有差异。　　近年来用于癫痫研究的动物模型多是通过化学方法或者电刺激诱导癫痫发生获得的，对遗传性癫痫的研究比较少见。本实验以遗传性癫痫动物模型-震颤大鼠(Tremor Rat，TRM)作为研究对象。TRM大鼠是一种理想的研究遗传性癫痫小发作的动物模型，1980年由日本京都大学医学部附属动物实验室通过Kyo:Wistar大鼠近亲杂交繁殖培育产生，为Tm基因突变的结果。出生10周后出现癫痫发作，主要表现为失神样的癫痫，特点是突然停止运动与凝视，此时在大鼠脑皮质和海马可记录到阵发性的(5-7) Hz的棘-慢综合波[13,14]。应用这类动物疾病模型来研究人类疾病的最大优点是疾病的发生、发展与人类相应的疾病很相似，且对于抗癫痫药物的反应同癫痫患者类似，因此其应用价值很高。本研究拟利用这种癫痫动物模型尝试探讨在TRM癫痫发生时，NPY与电压门控性钠离子通道(Voltage-gated sodiumchannels, VGSC)重要的两个亚型Nav1.1和Nav1.2的表达变化以及可能存在的相互作用关系。此外，还尝试揭示脑内不同部位NPY受体Y1R、Y2R和Y5R的表达变化与分布，一方面为遗传性癫痫基因治疗奠定基础;同时也为解释TRM癫痫发生的机制以及筛选抗癫痫特异性药物靶点提供有价值的理论依据。　　实验材料和方法：　　1、材料　　动物、试剂与仪器:健康TRM和正常Wistar大鼠9-12周龄，每组6-8只，体重150-200g，雌雄不限。TRM为2000年从日本京都大学引进遗传性癫痫大鼠，自行繁育培养。健康Wistar大鼠由中国医科大学实验动物部提供。引物设计合成由Takara公司完成;逆转录试剂盒，Taq酶购自Takara公司;NPY ELISA试剂盒购自USCN LIFE SCIENCE;所用一抗除GAPDH和β-actin购自Santa Cruz公司，其余均购自ABCAM公司;免疫组化SP试剂盒购自中杉金桥生物公司;0.45μmPVDF购自Millipore公司;胎牛血清粉末购自SIGMA公司;羊抗兔和羊抗小鼠 IgG-HRP购自中杉金桥生物公司;FITC标记羊抗兔二抗、Cy3标记的羊抗小鼠二抗购自中杉金桥生物公司;ECL化学发光试剂盒购自Thermo公司;免疫组化SP试剂盒购自中杉金桥生物公司;DAB显色试剂盒中杉金桥生物公司。PCR仪(美国BIOMETRA);紫外分光光度计(美国Bio-Rad);Centrifuge5810R低温冷冻离心机(德国Eppendorf);光学显微镜（日本Olympus）;石蜡切片机（德国Leica1516）;冰冻切片机;荧光显微镜(日本Olympus); Westem垂直电泳仪及转印仪(美国Bio-Rad);图像分析系统。　　2、方法　　鼠尾基因鉴定:TRM约4周龄时做标记后剪鼠尾，酚氯仿法提取总DNA。利用特异性扩增Tm基因的引物进行PCR反应后电泳。　　免疫印迹分析:乙醚麻醉TRM和Wistar正常对照大鼠，断头取脑后快速分离海马组织和颞叶皮质提取总蛋白，BCA法进行蛋白浓度测定。加入1×SDS-PAGEloading buffer，100℃煮沸变性5分钟后冷却至室温，-80℃分装保存。灌制12％分离胶和5％浓缩胶。加入变性后的蛋白样品和预染marker。每个上样孔上50μg蛋白。初始电压80V，50分钟后调整电压到120V，60分钟后，采用湿转三明治体系，横流200mA，转印2小时。将PVDF膜放入5％BSA溶液中，室温封闭2小时。孵育一抗，4℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入二抗工作液，TBST洗膜后，按ECL说明书，加入ECL反应液，显影后可见密度强度不一的条带。　　免疫荧光双标记检测:TRM和Wistar大鼠麻醉后，4％多聚甲醛心脏灌流，迅速取脑，4％多聚甲醛固定24h后30％蔗糖沉糖24h。OCT复合物完全包埋，冰冻切片机进行10μm厚的连续冠状切片，-80℃冰箱保存。0.01 mol/L PBS漂洗3次，1％正常牛血清蛋白及0.2％ Triton X-100孵育90min，分别加入一抗混合物，4℃湿盒过夜。次日PBS清洗，在暗室中加入FITC标记羊抗兔与Cy3标记羊抗小鼠二抗混合物，避光孵育2h后加入DAPI标记细胞核并用甘油封片。荧光显微镜下观察。　　ELISA检测:从剥离的海马以及颞叶皮质组织中提取总蛋白并且测浓度，将所用样品浓度稀释到3μg/μl。其余步骤按照ELISA试剂盒说明书操作。所有试剂盒内试剂和样品室温平衡30分钟。依次加入不同浓度的标准品和样品，然后立即每孔加检测溶液A工作液。37℃孵育1小时，弃去孔内液体，每孔用洗涤液洗涤，要把孔内的洗涤液完全甩干。每孔加检测溶液B工作液，加上覆膜，37℃孵育30分钟，弃去孔内液体，每孔加底物溶液，酶标板加上覆膜，37℃避光显色，反应时间约20分钟。每孔加终止溶液，终止反应，在确保酶标板板底无水滴和孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值。　　RT-PCR分析:从剥离的海马以及颞叶皮质组织中提取总RNA，参照TAKARA逆转录试剂盒说明书进行cDNA合成。以cDNA为模板，根据目的基因特异序列设计引物，进行PCR扩增，得到的目的条带利用软件分析平均灰度值，将其与内参GAPDH平均灰度值的比值作为目的基因mRNA相对表达水平。　　免疫组织化学分析:将新鲜分离的大脑固定脱水后，石蜡包埋并定位，将蜡块放入石蜡切片机，切成4μm厚度冠状连续切片，烤片后备用。在二甲苯Ⅰ，Ⅱ中各放15分钟脱蜡，梯度酒精脱水后用免疫组化笔圈出组织位置。山羊免疫正常血清封闭非特异性结合位点，室温孵育15分钟。加入一抗工作液孵育切片。4℃孵育过夜后，加入二抗37℃孵育1小时，PBS洗片，滴加SP试剂，室温孵育20分钟，PBS洗片，滴加DAB显色液反应5分钟，苏木素核复染1分钟。梯度酒精水化，透明后中性树胶封片。200倍和400倍光学显微镜下观察并分析实验结果。　　统计学分析:各组所得结果均以平均数±标准差表示，两组间比较用t检验，p＜0.05作为差异有统计学意义。　　结果：　　鼠尾基因鉴定:筛选出TRM备用并按性别分笼饲养。　　免疫印迹检测结果显示:在TRM海马中，两种钠通道亚型蛋白表达明显高于Wistar对照组(Nav1.1:0.72±0.05 in TRMs vs.0.41±0.03 in control rats,p＜0.01;Nav1.2:0.81±0.05 in TRMs vs.0.61±0.04 in control rats，p＜0.01)。而在颞叶皮质中的表达趋势则相反(Nav1.1:0.39±0.02 in TRMs vs.0.63±0.05 in control rats，p＜0.01;Nav1.2:0.42±0.04 in TRMs vs.0.71±0.06 in control rats，p＜0.01)。此外，在TRM海马中，Y1R表达明显低于正常Wistar对照组(0.57±0.11 in TRMs vs.0.82±0.06 incontrol rats，p＜0.01)，Y2R表达则明显高于对照组(0.88±0.10 in TRMs vs.0.59±0.11in control rats，p＜0.01)，而Y5R相较于Wistar大鼠没有明显改变（0.43±0.09 in TRMsvs.0.34±0.05 in control rats, p＞0.05）。在TRM颞叶皮质中，Y1R和Y2R表达均明显高于对照组(Y1R:0.85±0.06 in TRMs vs.0.54±0.07 in control rats, p＜0.01; Y2R:0.77±0.08 in TRMs vs.0.48±0.09 in control rats, p＜0.01)，而Y5R的蛋白表达仍没有明显变化(0.37±0.07 in TRMs vs.0.31±0.04 in control rats, p＞0.05)。　　免疫荧光检测结果显示: Nav1.1与Nav1.2在海马CA1, CA3的椎体细胞和DG区的颗粒细胞层，以及颞叶皮质中均广泛分布，且主要表达在神经元细胞膜和树突上。这两种VGSC亚型在海马CA1、 CA3和DG部位阳性细胞数均出现明显的增加(Nav1.1: CA1:55.62±6.05 in TRMs vs.28.23±6.01 in control rats, p＜0.01;CA3:67.03±5.12 in TRMs vs.53.217±4.93 in control rats, p＜0.01; DG:32.14±4.97 inTRMs vs.24.76±5.43 in control rats, p＜0.01; Nav1.2: CA1:62.12±5.09 in TRMs vs.33.17±5.32 in control rats, p＜0.01; CA3:61.56±4.95 in TRMs vs.42.65±5.12 in controlrats, p＜0.01; DG:44.22±5.32 in TRMs vs.22.12±6.21 in control rats, p＜0.01），而在颞叶皮质部位则明显减少（Nav1.1:20.12±3.55 in TRMs vs.43.76±5.12 in control rats,p＜0.01; Nav1.2:32.45±7.01 in TRMs vs.49.21±5.76 in control rats, p＜0.01）。此外，我们在上述部位还发现了NPY与Nav1.1与Nav1.2存在共定位。　　ELISA结果显示:相较于Wistar大鼠，TRM大鼠在海马和颞叶皮质中，NPY的含量均显著上升(海马:58.72±5.23 in TRMs vs.24.98±3.56 in control rats, p＜0.01;颞叶皮质:48.42±4.09 in TRMs vs.23.59±4.87 in control rats, p＜0.01, pg/ml)。　　RT-PCR结果显示:TRM海马中，NPY和Y2R的mRNA相对表达含量显著高于正常对照组（NPY:0.75±0.08 in TRMs vs.0.40±0.10 in control rats,p＜0.01; Y2R:0.77±0.08 in TRMs vs.0.48±0.09 in control rats, p＜0.01）。Y1R的mRNA相对表达含量显著低于正常对照组（0.59±0.11 in TRMs vs.0.88±0.10 in control rats, p＜0.01）;但是Y5R没有明显变化(0.67±0.09 in TRMs vs.0.65±0.05 in control rats, p＞0.05)。而在TRM颞叶皮质中，NPY、 Y1R和Y2R的的mRNA相对表达含量均比正常对照组高(NPY:0.62±0.11 in TRMs vs.0.47±0.12 in control rats,p＜0.01; Y1R:0.92±0.12in TRMs vs.0.60±0.10 in control rats, p＜0.01; Y2R:0.90±0.07 in TRMs vs.0.59±0.08in control rats, p＜0.01), Y5R依然没有明显变化(0.79±0.10 in TRMs vs.0.75±0.12 incontrol rats, p＞0.05)。　　免疫组织化学检测结果显示:NPY在TRM海马和颞叶皮质区均有广泛的表达和分布。而在TRM海马CA1、CA3和DG区，NPY阳性细胞数均明显高于正常Wistar对照组(CA1:48.28±5.34 in TRMs vs.23.98±4.98 in control rats，p＜0.05;CA3:50.12±4.56 in TRMs vs.28.32±7.31 in control rats,p＜0.05; DG:34.31±5.01 inTRMs vs.15.48±3.20 in control rats，p＜0.01），在颞叶皮质中，NPY的阳性细胞数也显著增加(62.11±5.23 in TRMs vs.30.05±4.98 in control rats，p＜0.01);此外，我们还检测了Y1R、Y2R和Y5R在TRM脑内的分布。结果显示，这三种NPY受体亚型在TRM海马CA1、CA3、DG区以及颞叶皮质区也都有广泛的分布，包括CA1和CA3锥体细胞层以及DG区的颗粒细胞层，且主要定位在细胞膜以及神经元部分轴突上。通过阳性细胞数统计分析，我们发现，Y1R在TRM海马CA1和CA3表达下调(CA1:19.33±4.32 in TRMs vs.27.01±3.52 in control rats，p＜0.05; CA3:55.83±9.45 in TRMs vs.70.50±6.69 in control rats，p＜0.05)，DG区表达没有明显变化(29.33±3.55 in TRMs vs.27.33±5.24 in control rats，p＞0.05)，但是在颞叶皮质区表达上调(68.83±8.82 in TRMs vs.47.17±10.62 in control rats，p＜0.05); Y2R在海马和颞叶皮质中的表达均明显增加(CA1:53.03±4.77 in TRMs vs.40.31±4.27 in control rats，p＜0.01; CA3:83.17±7.82 in TRMs vs.67.51±7.82 in control rats, p＜0.05; DG:26.53±4.96 in TRMs vs.18.67±3.14 in control rats，p＜0.05;颞叶皮质:73.17±7.46 inTRMs vs.43.33±5.04 in control rats，p＜0.01），Y5R仅在海马DG区表达下降(DG:24.53±3.96 in TRMs vs.29.57±5.74 in control rats，p＜0.05)，在其他部位表达无明显变化(CA1:19.33±8.16 in TRMs vs.19.01±5.22 in control rats,p＞0.05; CA3:55.47±6.82 in TRMs vs.49.33±5.31 in control rats，p＞0.05;颞叶皮质:23.17±7.66 inTRMs vs.22.17±6.68 in control rats,p＞0.05)。　　结论：　　1、首次发现，相较于正常Wistar大鼠，TRM海马中Nav1.1和Nav1.2蛋白表达出现上调，而在颞叶皮质中则表达下调。NPY能够与其发生共定位，说明NPY可能与这两种VGSC亚型存在相互作用。　　2、首次发现，相较于正常Wistar大鼠，TRM海马和颞叶皮质中，NPY表达显著上调。在TRM海马CA1、CA3和DG区以及颞叶皮质中，NPY均广泛分布和表达，说明NPY可能参与TRM的癫痫发生。　　3、首次证实，相较于正常Wistar大鼠，TRM海马和颞叶皮质中，Y1R和Y2R的mRNA水平以及蛋白水平表达出现异常变化。Y5R的表达无论在mRNA水平或是蛋白水平均没有明显变化，其在TRM海马和颞叶皮质中均有表达分布。说明NPY/NPYR作为内源性神经保护系统在TRM脑内可能已经被启动。　　4、TRM是一种良好的癫痫小发作动物模型，能够利用其研究NPY在遗传性癫痫发生发展中的作用。　　5、本研究结果在探讨遗传性癫痫分子机制以及筛选抗癫痫药物和基因治疗中有重要意义。