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蜂王浆是养蜂生产中主要的蜂产品之一,王浆高产意大利蜜蜂的产浆量是原种意大利蜜蜂的10倍以上。蜂王浆是由咽下腺和上颚腺的分泌物组成。咽下腺是工蜂特有的合成及分泌蜂王浆蛋白的主要外分泌腺,其发育程度和泌浆活性直接影响到工蜂分泌蜂王浆的产量和质量。虽然咽下腺分泌王浆蛋白的机制已经在细胞和蛋白质水平上进行了一些探索,但microRNA（miRNA）对咽下腺合成及分泌王浆蛋白的分子调控机制尚不清楚。本研究以王浆高产蜜蜂-浆蜂（RJBs）为研究对象,采用组织形态学、分子生物学等技术,探究浆蜂咽下腺泌浆阶段的组织形态变化、miRNA表达差异及其靶基因表达规律,筛选与泌浆相关的miRNA,以期阐明miRNA调控蜜蜂咽下腺活性的分子机制。主要研究结果如下:1.不同日龄工蜂咽下腺的形态学观察试验选取群势相近、健康的浆蜂姐妹蜂王群5群。分别采集新出房（Newly emerged worker,NE）、3、6、9、12、15、18、21、24、27和36日龄工蜂,每个日龄解剖20只工蜂咽下腺用于组织形态学研究。扫描电镜和透射电镜观察不同日龄蜜蜂咽下腺腺泡表面形态和分泌细胞的超微结构,主要结果:1)随着工蜂日龄的增加,咽下腺腺泡直径总体上呈现先增加后减小的趋势,9日龄工蜂咽下腺直径最大,12日龄后腺泡直径开始下降（P<0.05）。2)透射电镜结果发现,随着日龄的增加,腺泡分泌细胞内粗面内质网是变化最为明显的细胞器,6日龄时咽下腺分泌细胞内粗面内质网多呈长管状,其外表面附着核糖体较少;而9日龄时咽下腺分泌细胞内粗面内质网密集存在于细胞核周围,其外表面附有大量核糖体;15日龄后咽下腺腺泡细胞内粗面内质网数量开始下降;18日龄后粗面内质网开始退化,粗面内质网开始空泡化。2.不同日龄工蜂咽下腺发育相关基因的表达采集NE、3、6、9、12、15、18、21、24、27和36日龄工蜂,每个日龄每群蜂解剖60只工蜂咽下腺用于测定咽下腺发育相关基因的表达。主要结果:9日龄时咽下腺中王浆主蛋白1（Major royal jelly protein 1,MRJP1）、王浆主蛋白3（Major royal jelly protein3,MRJP3）和真核细胞起始因子（eukaryotic translation initiation factor 4 gamma,Eif4g）的表达水平显著高于其他日龄（P<0.05）,但是细胞凋亡蛋白酶1（Caspase 1,Cas1）、细胞凋亡蛋白酶8（Caspase 8,Cas8）、P53和TOR基因在18或者21日龄时出现峰值（P<0.05）;P70 S6酶（P70 S6 kinase,P70S6K）基因在21日龄时的表达水平最高,3日龄时表达水平最低（P<0.05）。3.不同日龄咽下腺miRNA表达谱分析Illumina HiSeqTM4000双末端测序技术测定第6、9和12日龄工蜂咽下腺总miRNA表达水平。生物信息学分析咽下腺miRNA测序结果显示:1)共获得115.89 M clean reads。将clean reads和已知的miRNA数据库进行比对,检测到322个miRNA,其中已知的miRNA 159个,新预测的miRNA 163个。2)6 d vs 9 d共有27个差异表达的miRNA;6 d vs 12 d共有16个差异表达的miRNA;9 d vs 12 d共有11个差异表达的miRNA。3)miRNA预测靶基因共1,828个,并完成对差异表达miRNA靶基因的功能注释和富集分析。KEGG通路富集分析显示,54个差异表达miRNA靶基因被注释到生理节律信号通路（Circadian rhythm）、Hippo信号通路（Hippo signaling pathway）、FoxO信号通路（FoxO signaling pathway）、细胞吞噬体通路（Phagosome）、嘌呤代谢通路（Purine metabolism）和真核生物核糖体生物合成通路（Ribosome biogenesis in eukaryotes）等（P<0.05）。4)差异表达miRNA靶基因GO功能富集分析结果显示,差异表达miRNA靶基因GO聚类主要集中在有机物质运输（organic substance transport）、转运（transport）、囊泡介导转运（vesicle-mediated transport）、离子跨膜运输（ion transmembrane transport）、系统发育（growth）等。4.ame-miR-184对蛹期咽下腺发育的影响移取1日龄工蜂幼虫置于48孔细胞培养板中,采用室内人工幼虫饲养技术饲喂直至化蛹。成功化蛹的幼虫移至化蛹板,平均分为4组,每组三个重复,每个重复48只蜜蜂。试验组分别在红眼蛹的头部两触角之间注射0.5μL/只的mimics（过表达组）、mimics NC（过表达阴性对照组）、inhibitor（干扰表达组）或inhibitor NC（干扰表达阴性对照组）试剂,处理3 h后取样并对相关指标进行测定。试验结果表明:1)ame-miR-184对羽化率影响显著,inhibitor组和mimics组羽化率显著降低（P<0.05）。2)ame-miR-184过表达,能够显著抑制靶基因胰岛素样受体（insulin-like receptor,InR2）和细胞周期依赖激酶（cyclin dependent kinase 12,CDK12）的表达（P<0.05）,抑制MRJP1和MRJP3基因的表达（P<0.05）,显著降低酮戊二酸脱氢酶基因（2-oxoglutarate dehydrogenase,Ogdh）和柠檬酸合成酶基因（Polycomblike,Pcl）的表达（P<0.05）。3)ame-miR-184干扰表达时,可显著升高Ogdh、Pcl以及MRJP3的表达（P<0.05）,靶基因InR2和CDK12基因的表达也显著升高（P<0.05）。5.ame-miR-184对成蜂咽下腺发育的影响试验第1天标记足量新出房工蜂,采集9日龄被标记蜜蜂放于蜜蜂饲养盒内。共采集新出房工蜂720只,随机分为4组（mimics组、mimics NC组、inhibitor组和inhibitor NC组）,每组3个重复,每个重复60只蜜蜂,于室内蜜蜂饲养盒中饲养。分别在头部触角之间注射0.5μL/只的mimics、mimics NC、inhibitor或inhibitor NC试剂。试验结果表明:1)mimics组成蜂存活率显著低于其他组（P<0.05）,inhibitor组成蜂存活率与对照组无差异（P>0.05）。2)ame-miR-184过表达时,ame-miR-184的表达水平显著升高（P<0.05）,抑制靶基因InR2和CDK12的表达（P<0.05）,抑制MRJP1、MRJP3、TOR和Eif4g基因的表达（P<0.05）。3)ame-miR-184干扰表达时促进靶基因InR2和CDK12的表达（P<0.05）,促进MRJP3的表达（P<0.05）,促进TOR信号通路关键基因TOR、Eif4g的表达（P<0.05）。以上结果表明,通过生物信息学分析,筛选到与咽下腺泌浆活性相关的ame-miR-184。ame-miR-184通过促进线粒体代谢关键酶基因以及TOR信号通路关键基因的表达促进咽下腺王浆蛋白的合成。