镉(Cadmium,Cd)是环境中常见的重金属污染物,Cd对机体肾小管的毒性作用会继发维生素D的代谢紊乱,从而引发软骨症、自发性骨折、禽痛风等代谢性疾病。禽类软骨疾病较难治愈,而软骨细胞是软骨的唯一组成细胞,因此以软骨细胞为研究对象,研究其增殖分化和生理功能变化,对了解Cd引起的软骨类疾病的发生和防治机理具有重要意义。1α,25-二羟维生素 D3(1α,25-dihydroxyvitamin D3,1α,25-(OH)2D3)是维生素D在体内最强的生物活性形式,1α,25-(OH)2D3能直接作用于骨细胞,参与维持骨稳态的平衡,但其能否改善Cd对鸡胚原代软骨细胞的毒性作用仍需进一步研究。因此,本试验旨在建立一个稳定的鸡胚原代软骨细胞的体外培养体系,从细胞水平观察1α,25-(OH)2D3和Cd对软骨细胞表型、增殖分化、凋亡及其它生理功能的影响,并探究1α,25-(OH)2D3是否能改善Cd对鸡胚原代软骨细胞的毒性作用,为临床上1α,25-(OH)2D3防治Cd致家禽软骨类疾病的研究提供理论依据。1鸡胚原代软骨细胞的分离培养与表型鉴定本试验采用胰蛋白酶和Ⅳ型胶原酶分步消化法获取鸡胚长骨关节软骨细胞,阿利新蓝染色鉴定软骨细胞酸性粘多糖表达,倒置显微镜观察软骨细胞形态,CCK-8检测软骨细胞增殖率,qRT-PCR检测软骨细胞分化标志基因。结果显示,分离细胞酸性粘多糖表达强阳性,呈现典型“铺路石”状,符合软骨细胞特征;软骨细胞在体外培养到5d时增殖明显加快;随着体外培养时间的延长,软骨细胞早期分化相关标志性基因Sox9、COL2A1、ACAN mRNA表达量逐渐降低,晚期分化相关基因Mmp-9、RANKL mRNA表达量逐渐升高。表明,获取的鸡软骨细胞能够在体外培养过程中向终末期正常分化成熟。2 维生素D对鸡胚原代软骨细胞增殖分化及生理功能的影响为探究不同浓度1α,25-(OH)2D3(10-8,10-9,10-10 mol/L)对鸡胚原代软骨细胞的影响,采用CCK-8、qRT-PCR、Western blot和免疫荧光等技术检测相关指标。结果显示,不同浓度1α,25-(OH)2D3对软骨细胞的增殖有促进作用,能维持软骨细胞在体外培养过程中的正常分化表型,并促进软骨细胞早期分化相关基因Sox 9、ACAN mRNA的表达,10-8 mol/L 1α,25-(OH)2D3 效果最明显;10-8 mol/L 1α,25-(OH)2D3 还能显著促进软骨细胞外基质主要成分COL2A1的表达。表明,1α,25-(OH)2D3对鸡胚原代软骨细胞的增殖、分化及生理功能起到了积极的促进作用。3镉对鸡胚原代软骨细胞的毒性作用为探究Cd对鸡胚原代软骨细胞的毒性影响,采用不同浓度Cd(0,0.5,1,2,4,6,8,10μmol/L)处理细胞,通过 CCK-8、qRT-PCR、Western blot、流式细胞术、阿利新蓝染色等技术检测相关指标。结果显示,0.5 μmol/L以上Cd能显著促进软骨细胞凋亡;1μmol/L以上Cd明显抑制软骨细胞的增殖,并抑制软骨细胞早期分化基因Sox 9、Aggrecan mRNA的表达以及COL2Al的表达;2μmol/L以上Cd能明显抑制软骨细胞分泌酸性粘多糖,并促进基质金属蛋白酶Mmp-9的表达。表明,Cd能抑制鸡胚原代软骨细胞的增殖、早期分化,并促进软骨细胞的凋亡和细胞外基质降解。4维生素D对镉致鸡胚原代软骨细胞毒性损伤的保护作用为探究1α,25-(OH)2D3对Cd致鸡胚原代软骨细胞毒性损伤的保护作用,选取10-8 mol/L 1α,25-(OH)2D3 和 2μmol/L Cd 联合处理软骨细胞,采用 CCK-8、Western blot、流式细胞术、免疫荧光、阿利新蓝染色等技术检测相关指标。结果显示,1α,25-(OH)2D3能缓解Cd对软骨细胞COL2Al和酸性粘多糖表达的抑制作用,明显改善Cd对软骨细胞的增殖毒性,并抑制Cd的促凋亡作用。1α,25-(OH)2D3还能降低Cd作用下的Mmp-9的过度表达,来缓解软骨细胞外基质的降解。表明,1α,25-(OH)2D3在Cd致鸡胚原代软骨细胞毒性损伤中起到了保护作用。