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荷花是莲科（Nelumbonaceae）莲属（Nelumbo）多年生水生观赏植物,不仅是中国的传统名花,也是印度和越南的国花,具有重要的观赏价值和文化内涵,是世界著名的食用和药用植物。中国是荷花资源最丰富的国家,品种数量超过1000个,占世界荷花全部品种数量的一半左右,为荷花相关科研及产业的发展做出了重要贡献。荷花可分为两大类:亚洲莲（N.nucifera）和美洲莲（N.lutea）。亚洲莲花色有红色、粉红色、白色和杂色等颜色,美洲莲仅有淡黄色。尽管荷花的花型较多,但同睡莲相比,花色较单一,缺乏紫色、蓝色、深黄色等深色系列品种,使其观赏价值受到一定限制。由于品种特性限制,通过传统的杂交育种方式几乎无法培育出深色系列的荷花品种,唯有通过分子育种的途径来实现突破。但目前荷花的基因组测序和转录组测序工作刚起步,对决定花色的花色素代谢途径的研究还是空白,因此十分必要开展这方面的基础研究工作。分子生物学的崛起和植物基因工程等技术的发展为荷花花色研究提供了新的方法。本研究以洪湖红莲花蕾为材料,分别克隆与花色素形成途径相关的关键酶基因,主要包括 CHS（Chalcone synthase）基因、F3’5’H（flavonoid3’,5’-hydroxylase）基因,同时对这几个基因的表达模式进行了分析。并分别构建了植物表达载体pHB-2×35S-NnCHS2、pHB-2×35S-NnCHSA、pHB-2×35S-NnCHS438、pHB-2×35S-NnF3’5’H。通过农杆菌介导的花粉管导入法转化拟南芥、以农杆菌介导的叶盘法转化矮牵牛和瓦氏秋海棠并对转基因植株进行了检测分析。同时将构建成功后的植物表达载体分别注射到矮牵牛和荷花的花瓣中进行瞬时表达,观察到矮牵牛白色花花瓣和粉红色花花瓣的颜色均发生了变化,瞬间转化荷花花瓣的GUS染色也产生明显颜色变化。研究结果将为开发荷花新品种和改良花色提供技术基础和理论参考。主要研究内容及结果如下:1、以荷花花瓣的cDNA为模板,根据荷花转录组设计特异性引物,利用常规PCR技术分别克隆出荷花中控制花色的关键基因NnCHS2、NnCHSA、NnCHS438与NnF3’5’H,并进行生物信息学分析。用Real-time quantitative PCR技术对荷花不同花色系品种、荷花不同生长时期、荷花不同生长组织及器官的大部分花色素代谢途径关键酶基因进行表达量的分析。得出以下结论:（1）对红色品种（洪湖红莲）、黄色品种（美洲莲）和白色品种（白洋淀白莲）中成熟花瓣的关键酶基因的表达情况进行检测。和红色品种比较发现,这些关键酶基因的表达缺失或低表达是白色品种和黄色品种不显示深颜色的主要原因。（2）NnF3’5’H基因的活性偏低极有可能是荷花中缺乏蓝色、紫色等深色系品种的原因。（3）NnCHS4相较于试验中重点研究的另外3个基因——NnCHS2、NnCHS438、NnF3’5’H来说表达量普遍较低,但其在雄蕊、雌蕊和花瓣中表达量相对较高,属于花特异表达的基因;NnCHS2的基因表达量相比于其他基因普遍较高,在各组织中表达较为平均。（4）关键酶基因的表达量在花发育后期阶段普遍呈现下降趋势,说明关键酶基因表达量的下降可能是荷花花色变浅的主要原因。2、分别构建植物表达载体 pHB-2×35S-NnCHS2、pHB-2×35S-NnCHSA、pHB-2×35S-NnCHS438、pHB-2×35S-NnF3’5’H。通过农杆菌介导法将构建好的植物表达载体转化到拟南芥、矮牵牛、瓦氏秋海棠中。初步总体获得了 13株拟南芥抗性幼苗。经PCR检测所获得的转基因植株较少,并且没有观测到明显的生物学表型变化。3、在荷花花瓣中建立农杆菌介导瞬时表达技术体系,实验结果显示,该方法可以应用在荷花表达体系中。双子叶特异的农杆菌感受态GV3101与LBA4404可以很好的侵染荷花花瓣,而单子叶的农杆菌感受态EHA105不具备侵染荷花花瓣的能力。将pCAMBIA1301-GUS、pCAMBIA2301-GUS载体以农杆菌介导的方法分别导入荷花的花瓣中进行瞬时表达,可以观察到荷花花瓣中GUS基因的表达,GV3101与LBA4404感受态所培养出的农杆菌在瞬间转化荷花实验中并没有存在明显的效果差别。4、用准备好的 pHB-2×35S-NnCHS2、pHB-2×35S-NnCHSA、pHB-2×35S-NnCHS438、pHB-2×35S-NnF3 ’5’H农杆菌渗透液瞬间转化矮牵牛。白色、粉红色矮牵牛花瓣中均有表达,白色矮牵牛花瓣中呈现出深浅不一、大小面积不同的紫红色色斑,粉红色矮牵牛花瓣中可以看到瞬转效果更加明显的紫色色斑。NnF3’5’H基因在白色花瓣中瞬转出的颜色要比NnCHSA基因颜色深、NnCHSA基因在白色花瓣中瞬转出的颜色要比NnCHS2基因颜色深。但从DNA的PCR情况以及表达量情况来看,结果并不具有明确的说服力,与瞬间转化花瓣颜色变化并不一致,怀疑结果具有假阳性,需要进一步实验证明。