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猫冠状病毒(Feline coronavirus,FCoV)是尼多病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属的成员,是一种基因组为单股正链RNA的病毒。FCoV有猫肠道冠状病毒(Feline enteric coronavirus,FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis viruses,FIPV)两种生物型。猫感染FECV后,在临床上仅表现为轻微的肠道疾病。但感染FIPV的猫则会罹患致死率很高的传染性腹膜炎。目前,FCoV广泛存在于世界各地猫群中,成为感染猫科动物的一种常见病原。由于FIPV的体外培养比较困难,关于FIPV的基础研究和疫苗研究进展都比较滞后。迄今,尚无有效的疫苗,对猫科动物的健康构成严重威胁。目前,我国关于FIPV的流行病学研究资料还比较少,也缺乏有效的检测手段。为此,本研究开展了FIPV的分离鉴定和检测方法建立的工作,以期为进一步开展流行病学研究提供技术手段。本论文的研究内容包括以下三个方面:1、FIPV HF1902株的分离与鉴定。本研究从临床上收集到一例疑似猫传染性腹膜炎的病料,组织病理学结果显示肝脏、肾脏和肠道中有巨噬细胞聚集在血管周围,同时伴有密集的淋巴细胞(主要是B细胞)和浆细胞浸润。将其肝脏研磨并匀浆过滤,然后抽提总RNA,用RT-PCR方法进行鉴定,结果成功检测到FIPV的N基因;将组织研磨液过滤除菌后,接种于猫胚胎细胞(Felis catus whole fetus,FCWF-4),盲传到第3代,出现细胞变圆、聚集、脱落等特征性细胞病变;收集培养的病毒,经超速离心后,将病毒浓缩和纯化,用电子显微镜观察病毒,可看到直径约100 nm左右、具有典型冠状病毒形态特征的病毒颗粒。同时,我们还用间接免疫荧光(IFA)和蛋白质免疫印迹试验(Western blot)对病毒进行免疫学鉴定,结果均检测到FIPV N蛋白在FCWF-4细胞中的表达。这些研究结果证明,我们成功分离到了一株FIPV,并将其命名为HF1902株。2、FIPV HF1902株的全基因组序列扩增与生物信息学分析。使用Primer Premier 5.0设计17对特异性引物,从病猫肝脏中成功扩增出HF1902株的全基因组序列。测序结果显示,HF1902株全基因组长29244 nt,G+C含量为38.11%,具有11个读码框(ORFs),分别编码4个结构蛋白(S、E、M、N)、5个辅助蛋白(7a、7b、3a、3b、3c),及两个非结构蛋白(1a、1b),编码区两端均存在非编码区(Untranslated region,UTR),其中5’UTR长303nt,3’UTR长255nt。利用DNASTAR软件及MEGA6.0软件,分别对HF1902株的N基因及S基因与参考序列进行了比对和分析。结果表明,HF1902株属FCoVⅠ型,其与FIPV参考毒株N基因的核苷酸同源性为90.6%～92.4%,S基因的核苷酸同源性为53.1%～90.0%。此外,通过对S基因中存在的功能分化相关位点进行分析结果发现,FCoV II型S1/S2裂解位点存在6个氨基酸(KRSRRP)的明显缺失,与FCoVⅠ型标准株相比,HF1902分离株的S1/S2裂解位点有三个氨基酸发生替换(R突变为S,S突变为A,P突变为S);对N蛋白的二级结构进行了预测,结果显示该蛋白具有高度亲水性,其二级结构主要由α螺旋(h)(14.06%)、延伸链(e)(15.12%)、β转角(t)(3.71%)和无规则螺旋(c)(67.11%)组成;无信号肽区域和跨膜结构域,存在48个潜在的磷酸化位点;含有6个潜在的B细胞抗原表位,2个CTL表位和2个Th表位。3、FIPV实时荧光定量PCR检测方法的建立。首先针对FIPV N基因设计一对特异性引物,然后经过PCR条件的优化,建立了一种可定性、定量检测FIPV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法不仅特异性好,而且敏感性强,最低检出量为10~2 copies/μL,比常规RT-PCR的灵敏度高1000倍;该方法组间重复性系数低于5%,具有良好的重复性。应用该方法,我们对临床收集的5只FIPV感染猫的组织脏器中的病毒载量进行了定量分析,结果显示,病猫的脾脏病毒载量最高,且与其它各器官中的病毒载量差异性很大,可达100倍。综上所述,本研究在临床上成功分离、鉴定了一株FIPV,并对其全基因序列进行了扩增和分析。同时还成功建立了一种特异性强、灵敏性高的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。本研究结果为进一步开展FIPV的流行病学、致病机理和疫苗研发等奠定了基础。