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肺腺癌是世界范围内与癌症死亡相关的主要原因,对人群健康和生命产生极大的威胁。然而目前仍缺乏早期诊断和预后的生物标记物来帮助指导肺腺癌的诊断和治疗。研究表明,新生血管数量与肺腺癌的发展显著相关。肺腺癌微血管内皮细胞特异性基因的异常表达可能为其预后和治疗提供线索。血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)是一种具有止血功能的多功能糖蛋白。据报道,除了止血作用,vWF还发挥抗肿瘤作用。然而,在肺腺癌中,vWF的表达模式和调控机制尚不明确。研究表明,转录因子GATA调控血管内皮细胞中vWF的基础表达,然而GATA是否调节肺腺癌微血管中vWF的表达尚未有人研究。为了进一步探究肺腺癌中vWF的表达模式及其调控机制,本研究检测了不同肺腺癌组织中vWF的表达,探讨其与肺腺癌发展程度的关系,并且建立肺腺癌条件培养基与内皮细胞共培养体外模型,进一步揭示转录因子GATA3对vWF的转录调控机制,旨在为肺腺癌的诊断、治疗及预后提供新的线索。研究方法1、通过免疫组化的方法染色组织芯片(tissue microarrays,TMAs)检测肺腺癌标本的血管中vWF的表达。2、收集新鲜的肺腺癌组织标本,用实时定量聚合酶链锁反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)及免疫荧光染色的方法检测肺腺癌组织血管中vWF的表达。3、用Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)细胞皮下注射C57BL/6小鼠建立小鼠肺腺癌模型。用qRT-PCR及免疫荧光染色的方法检测肺腺癌组织血管中vWF的表达。4、收集A549细胞衍生的条件培养液((A549-CM)作用于人脐静脉内皮细胞建立共培养体系来模拟肺腺癌微环境对血管的作用。并用qRT-PCR,WB,免疫荧光来检测肺腺癌微环境对HUVECs中vWF表达的影响。用ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)检测vWF的分泌。5、在建立的共培养体系中用qRT-PCR,WB,免疫荧光检测ERG(Ets related gene)是否为肺腺癌微环境中受到影响而上调vWF的转录因子。6、在建立的共培养体系中用qRT-PCR,WB检测肺腺癌微环境是否影响GATA3(GATA binding protein 3)的表达。7、在建立的共培养体系中用小干扰RNA干扰GATA3的表达,并用qRT-PCR,WB检测干扰效率。并检测GATA3沉默后,肺腺癌微环境对vWF表达和分泌的影响。8、用ChIP(Chromatin immunoprecipitation)实验检测GATA3转录因子是否结合到vWF启动子的结合位点,并检测共培养体系中A549条件培养液的处理是否增强GATA3结合到vWF启动子的水平。研究结果1、组织芯片的免疫组化染色结果显示,正常肺组织血管vWF染色为阴性,肺腺癌及癌旁组织vWF染色出现阳性。而且,在肺腺癌血管中,vWF染色比癌旁组织明显。2、新鲜的人肺腺癌组织的qRT-PCR显示,在每个病人的标本中,与配对的正常组织相比,肺腺癌组织中vWF的mRNA水平显著升高;新鲜冰冻组织切片的vWF免疫荧光染色在肺腺癌血管中比在癌旁组织血管中更强。3、对小鼠肺腺癌模型中获得的正常肺组织和肺腺癌组织进行了检测。qRT-PCR显示,与小鼠正常肺组织相比,LLC肿瘤组织中vWF的mRNA显著上升;免疫荧光显示,与小鼠正常肺组织相比,LLC血管显示出更强的vWF染色。4、收集的A549条件培养液作用于HUVECs建立共培养体系来模拟肺腺癌微环境。qRT-PCR显示,vWF的mRNA水平显著增高。WB及免疫荧光染色检测到A549条件培养液处理过的HUVECs中vWF蛋白水平升高。ELISA检测到A549条件培养液处理过的HUVECs中vWF的分泌增多。这些结果显示A549条件培养液促进HUVECs中vWF的表达。5、在共培养体系中,qRT-PCR,WB和免疫荧光结果表明,A549条件培养液并不改变HUVECs中ERG的mRNA及蛋白水平,这表明ERG在HUVECs应答A549条件培养液使vWF升高中不起作用。6、在共培养体系中,qRT-PCR及WB结果都显示GATA3的表达升高。为了确认GATA3是上调vWF的转录因子,我们应用了小干扰si-RNA使GATA3沉默后,A549条件培养液不能使HUVECs中vWF的表达上调。这些发现表明GATA3是介导内皮细胞vWF升高的转录调节因子。7、ChIP实验证明了GATA3结合到HUVECs中vWF启动子的+220 GATA结合位点,并且A549条件培养液进一步增加了GATA3与+220GATA位点的结合。因此,A549条件培养液促进GATA3表达,GATA3是调控肺腺癌血管中vWF表达增强的转录因子。研究结论1、肺腺癌血管系统中vWF的表达增强。肺腺癌血管中vWF的高表达不是血管类型造成的,而是可能与肺腺癌的微环境有关。2、在建立的共培养体系中,从A549细胞中收集的条件培养基增加了HUVECs中vWF表达,表明增强的vWF表达是由肺腺癌分泌物调节的。转录因子GATA3,而不是ERG,介导vWF的升高。3、GATA3直接结合到人vWF启动子的+220 GATA结合位点,并且A549细胞条件培养基的处理显著增加了GATA3与vWF启动子的结合。综上所述,我们认为肺腺癌细胞的分泌物通过增强GATA3介导的vWF转录来升高肺腺癌内皮细胞中vWF的表达。