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目的:探讨脊髓Cdk5/p35与ERK1/2相互调控介导PPARγ活性在神经病理性疼痛(Neuropathic Pain,NP)中的作用。第一部分 Cdk5/p35在神经病理性疼痛发生发展中的作用方法:1、成功建立坐骨神经结扎(CCI)模型,随机分为假手术(sham)组和CCI组,于术前、术后3d,7d,14d和21d分别观察SD大鼠痛行为学的变化并测定机械痛敏(PWMT)和热痛敏(PWTL),免疫荧光及western blot的方法观察NP发生发展过程中脊髓水平Cdk5与p35的表达时间相和分布;CCI术后第14d采用免疫荧光双标方法检测脊髓背角p35与神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞共表达的情况及与Cdk5共表达的情况。2、SD大鼠随机分为 4 组:sham+DMSO 组、sham+roscovitine 组、CCI+DMSO 组、CCI+roscovitine组;在造模后第3d至14d连续鞘内注射Cdk5/p35抑制剂roscovitine(100 μg)或溶剂5%DMSO 10 μl,每天一次,观察对神经病理性疼痛大鼠的机械痛敏(PWMT)和热痛敏(PWTL)的影响。结果:与假手术组相比,CCI组大鼠术后各时间点PWMT和PWTL均明显降低(P<0.05),脊髓水平p35表达呈时间依赖性增高(P<0.05),并主要表达分布在脊髓背角,且与脊髓神经元(NeuN)和星形胶质细胞标志物(GFAP)共表达,但不与小胶质细胞标记物(IBA1)共表达。Cdk5的表达未见明显改变,且与p35共表达。与CCI+DMSO组相比,CCI+roscovitine组鞘内注射Cdk5/p35抑制剂roscovitine可显著改善大鼠的痛行为学,PWMT 和 PWTL 明显升高(P<0.05)。第二部分 ERK1/2在神经病理性疼痛发生发展中的作用方法:1、建立CCI模型,根据检测时间点随机分为5组,假手术组(sham组)、CCI-3d 组(CCI-3d)、CCI-7d 组(CCI-7d)、CCI-14d 组(CCI-14d)和CCI-21d组(CCCI-21d),采用免疫荧光及western blot的方法观察相应时间点NP发生发展过程中脊髓水平pERK1/2的表达时间相和分布;CCI术后第14d采用免疫荧光方法检测脊髓背角p35与pERK1/2共表达的情况。2、SD 大鼠随机分为 4 组:sham+DMSO 组、sham+U0126 组、CCI+DMSO 组、CCI+U0126组;在造模后第3d至14d连续鞘内注射ERK1/2上游MEK抑制剂U0126(5μg)或溶剂5%DMSO(10 μl),每天一次,观察对大鼠PWMT和PWTL的影响。结果:与假手术组相比,CCI组脊髓水平pERK1/2表达呈时间依赖性增高(P<0.05),并表达分布在脊髓背角,且与p35共表达。与CCI+DMSO组相比,CCI+U0126组鞘内注射U0126可显著改善大鼠的PWMT和PWTL,缓解痛行为学(P<0.05)。第三部分 PPARy依赖Cdk5/p35和pERK1/2介导神经病理性疼痛的发生发展方法:1、建立CCI模型,根据检测时间点随机分为5组,假手术组(sham组)、CCI-3d 组(CCI-3d)、CCI-7d 组(CCI-7d)、CCI-14d 组(CCI-14d)和CCI-21d组(CCI-21d),采用免疫荧光及western blot的方法研究NP发生发展过程中脊髓水平pPPARy的表达时间相和分布;CCI术后第14d采用免疫荧光双标方法检测脊髓背角p35与pPPARy共表达的情况。2、鞘内注射PPARy激动剂pioglitazone对NP机械痛敏和热痛敏的影响。SD大鼠随机分为 4 组:sham+DMSO 组、sham+pioglitazone 组、CCI+DMSO 组、CCI+pioglitazone组;在造模后第3d至14d连续鞘内注射PPARy激动剂pioglitazone(l00μg)或溶剂5%DMSO 10 μl,每天一次,观察对 NP 大鼠PWMT和PWTL的影响。3、SD大鼠随机分为4组:sham+DMSO组,sham+roscovitine 组,CCI+DMSO 组,CCI+roscovitine 组,在造模后第 3d至14d连续鞘内注射Cdk5/p35抑制剂roscovitine(100 μg)或溶剂5%DMSO 10 μl,每天一次,采用Western blot的方法研究roscovitine对pPPARγ表达的影响。4、SD大鼠随机分4组:sham+DMSO组,sham+U0126组,CCI+DMSO组,CCI+U0126组,在造模后第3d至14d连续鞘内注射ERK1/2上游MEK抑制剂U0126(5μg)或溶剂5%DMSO 10 μl,每天一次,采用Western blot的方法研究U0126对pPPARy表达的影响。结果:与假手术组相比,CCI组脊髓水平pPPARγ表达呈时间依赖性降低(P<0.05),并且表达在脊髓背角;脊髓pPPARy与p35存在共表达;鞘内注射PPARy激动剂pioglitazone可明显改善大鼠的PWMT和PWTL,缓解痛行为学(P<0.05);鞘内注射roscovitine和U0126明显增加脊髓背角pPPARy 的表达(P<0.05)。第四部分 Cdk5/p35与ERK1/2相互调控介导神经病理性疼痛的发生发展和炎症反应方法:1、建立CCI模型后,SD大鼠随机分为四组:sham+DMSO组,sham+roscovitine 组,CCI+DMSO 组,CCI+roscovitine 组。研究鞘内注射Cdk5/p35抑制剂roscovitine对NP诱发的Cdk5/p35和pERK1/2表达上调及对Cdk5/p35激酶活力的影响;2、SD大鼠随机分为四组:sham+DMSO组,sham+U0126 组,CCI+DMSO 组,CCI+U0126 组。研究鞘内注射 ERK1/2 的上游MEK抑制剂U0126对NP诱发的Cdk5/p35和pERK1/2表达上调及对Cdk5/p35激酶活力的影响;3、SD大鼠随机分为8组,sham+DMSO组、sham+roscovitine 组、sham+U0126 组、sham+pioglitazone 组、CCI+DMSO组、CCI+roscovitine 组、CCI+U0126 组、CCI+pioglitazone 组,在造模后第3d至14d连续鞘内注射相应药物或溶剂,每天一次,术后第14d取材做ELISA,检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNFα的表达。结果:鞘内注射Cdk5/p35抑制剂roscovitine可抑制NP诱发的p35和pERK1/2表达上调(P<0.05),Cdk5的表达未见明显改变(P>0.05);鞘内注射pERK 1/2上游MEK抑制剂U0126可抑制NP诱发的p35和pERK 1/2表达上调(P<0.05),Cdk5的表达未见明显改变(P>0.05);采用组织Cdk5/p35激酶活性光度检测试剂盒,用全自动酶标检测仪检测Cdk5/p35激酶活性的变化,结果表明roscovitine和U0126均能抑制Cdk5/p35激酶活力(P<0.05);鞘内注射Cdk5/p35的抑制剂roscovitine、ERK1/2的抑制剂U0126和PPARy的激动剂pioglitazone能明显抑制炎症反应,减少炎症因子IL-1β、IL-6、TNFα的表达(P<0.05)。结论:1、脊髓水平Cdk5/p35和pERKl/2参与介导NP的发生发展。2、脊髓水平PPARy的激活依赖于Cdk5/p35和pERK1/2参与介导NP的发生发展。3、脊髓水平Cdk5/p35和pERK1/2相互调控参与介导NP的发生发展,抑制神经炎症反应。