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氧连接氮乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)糖基化修饰是由O-GlcNAc转移酶(OGT)将尿苷二磷酸乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNA)上的GlcNAc部分添加到底物蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上的过程。O-GlcNAc修饰普遍存在于真核细胞中。已有的研究表明,O-GlcNAc修饰与包括癌症在内的几乎所有重大疾病和重要的生理病理过程密切相关。细胞内直接负责调节O-GlcNAc修饰的酶只有两种,即OGT和相应的O-GlcNAc糖苷酶(OGA)。既然OGT的活性异常导致的O-GlcNAc修饰改变与多种生理病理过程相关,那么如能通过体外手段调控OGT酶活性,将有望进一步揭示O-GlcNAc修饰的胞内功能与作用机制。小分子化合物作为OGT抑制剂与其它手段相比具有细胞透过性好、计量可控、作用通路简洁等显著的优点,而具有广泛应用背景。目前已有多个OGT小分子抑制剂被报道,这些小分子抑制剂部分是通过化学合成法模拟糖供体结构,而获得的糖供体类似物,部分是通过高通量筛选获得的糖供体类似物。然而,这些抑制剂仍存在靶点特异性差、细胞毒性强等缺点。本研究通过基于结构的虚拟筛选,在包含61000种化合物的TCM Database@Taiwan库中获得了200种具有最高Vina分数的小分子化合物。根据小分子与受体(OGT)的构象与结构多样性、新颖性,从200个最优化合物中选择12个候选化合物进行高效液相色谱OGT酶活抑制率化学分析,进一步获得一个对OGT活性抑制效果较好的小分子四氢穗花杉双黄酮(L01)。在体外利用UDP荧光素酶发光法检测L01活性,发现L01对OGT催化CKII肽段的O-GlcNAc修饰存在抑制活性;接着通过叠氮修饰的UDP-GalNAz化学选择性标记O-GlcNAc修饰的底物蛋白,利用点击化学(Click)反应,发现L01能够抑制OGT催化Nup62蛋白的O-GlcNAc修饰;通过UDP荧光素酶发光法检测证明了L01在体外不能抑制其它糖基转移酶活性说明L01具有良好靶点特异性。细胞水平,通过L01处理COS7、293、Hela、K562等细胞系,发现L01能够有效降低多种哺乳动物细胞内全蛋白的O-GlcNAc修饰水平,进一步利用免疫细胞化学分析和代谢标记法验证了上述结果。此外,利用免疫共沉淀技术,检测发现L01能降低Nup62的O-GlcNAc修饰,证明L01对特定蛋白的胞内O-GlcNAc修饰同样具有机制作用。利用分子动力学模拟(MD)分析L01与OGT结合模式,发现L01与OGT天然底物UDP的结合模式相近,L01部分结构伸入OGT底物结合口袋内,与附近的Asn557、Lys842、His920、Thr922等重要氨基酸残基形成氢键。利用氨基酸虚拟突变发现L01与野生型OGT和Asn557突变型(突变为Ala)OGT之间结合能存在明显差异,提示L01与Asn557形成的氢键对L01与OGT结合起到重要贡献。接着本文利用UDP荧光素酶发光法,计算L01对定点突变的Asn557突变型OGT催化活性的抑制效果,证明了Asn557对L01抑制活性的保持具有关键作用。最后本文比较了L01与已报道的OGT抑制剂OSMI-1的特异性和细胞毒性。使用CCK8法分析L01对COS7细胞和Hela细胞毒性,发现相同条件L01较OSMI-1具有低毒性的特点;使用L01处理COS7细胞,利用凝集素与蛋白免疫印迹检测L01对细胞其它糖链结构的影响,结果表明L01与OSMI-1类似,未对细胞其它糖链结构产生影响;通过流式细胞术检测L01对健康人原代外周血单核细胞(PBMCs)毒性,以及利用斑马鱼急性毒性模型检测L01急性毒性,均发现L01较OSMI-1具有低毒性特点。这些结果证明了L01在体外以及体内均具有低毒特征,提示L01具有较好的OGT靶向特异性。本研究通过化学与生物相结合方法,获得了一个全新结构且活性较好的OGT小分子抑制剂,该抑制剂较已报道的小分子具有特异性强、毒性低等特点。该OGT抑制剂有望做为先导化合物,并进行化学修饰,用于探寻OGT与底物结合的关键结构信息,并用于研究O-GlcNAc糖基化修饰的细胞内功能。