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目的:目前,恶性肿瘤是导致人类死亡的第二大疾病。据世界卫生组织报道,2018年全球范围内约有9600000人死于肿瘤。其中,乳腺癌是当今社会女性最常见的恶性肿瘤之一,同时也是女性肿瘤相关死亡最常见的原因,严重威胁女性的生命健康。越来越多的证据表明,乳腺癌的发生和维持可能受肿瘤内一小部分细胞的调控,这些细胞被称为肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)。肿瘤干细胞因具有较强的致瘤性,自我更新能力、转移能力及对放化疗的抗性,成为乳腺癌治疗的主要障碍。因此,探索CSCs中有效的肿瘤分子标志物和关键调控机制对乳腺癌治疗具有重要意义。长链非编码RNA(Long-chain non-coding RNA,lncRNA)被定义为长度大于200 nt,不具备蛋白编码能力的RNA分子。近年来越来越多的研究证实,lncRNA与多种肿瘤的发生发展密切相关。因此,探究lncRNA在肿瘤发生发展中的作用及其分子机制成为肿瘤研究的热点。本研究旨在探究长链非编码RNA HOTTIP(HOXA transcript at the distal tip)在乳腺癌干细胞(Breast cancer stem cells,BCSCs)的干性维持中的作用及其分子调控机制,为乳腺癌的诊断和治疗提供新靶点。研究方法:1、利用原位杂交技术(In situ hybridization,ISH)检测乳腺癌和癌旁组织中lncRNA HOTTIP的表达。同时采用Kaplan-Meier Plotter数据库分析HOTTIP表达量与乳腺癌预后的关系。2、利用无血清悬浮培养的方法培养MCF7和T47D细胞从而富集BCSCs,并对诱导产生的乳腺癌球囊干细胞进行干性鉴定。应用qRT-PCR方法检测正常乳腺上皮细胞MCF10A、乳腺癌亲代细胞及球囊干细胞中HOTTIP的表达水平。3、构建HOTTIP过表达的细胞模型以及HOTTIP敲低的细胞模型,采用流式细胞分析技术检测CD44~+/CD24~-肿瘤干细胞比例的变化;软琼脂集落形成实验和球囊形成实验考察细胞自我更新能力的改变;采用Western Blot检测OCT4、SOX2、CK14和CK18蛋白表达变化,考察HOTTIP对乳腺癌干性维持的作用。同时,构建BCSCs裸鼠移植瘤模型,考察HOTTIP对BCSCs成瘤能力的影响。4、原位杂交检测乳腺癌组织中miR-148a-3p表达水平。qRT-PCR检测乳腺癌亲代细胞和球囊干细胞中miR-148a-3p表达水平。构建miR-148a-3p过表达和沉默的细胞模型,利用流式细胞分析技术、软琼脂集落形成实验、球囊形成实验和Western Blot考察miR-148a-3p对乳腺癌干性的影响。5、应用DIANA软件预测HOTTIP是否与miR-148a-3p存在结合位点及其结合能力的强弱。根据软件预测的HOTTIP与miR-148a-3p结合位点设计荧光素酶质粒,然后采用双荧光素酶报告分析检测HOTTIP与miR-148a-3p是否可以直接结合。同时,利用qRT-PCR验证HOTTIP与mi R-148a-3p之间的调控作用。结果:1、HOTTIP在人乳腺癌中表达上升且与患者不良预后显著相关。(1)原位杂交结果显示与癌旁组织相比,HOTTIP在乳腺癌组织中高表达。QRT-PCR结果表明与正常乳腺上皮细胞MCF10A相比,乳腺癌细胞中HOTTIP的表达量明显升高。同时,使用KM ploter检索发现HOTTIP与患者不良预后显著相关。(2)分析不同乳腺癌组织中HOTTIP表达,发现与非CD44~+/CD24~-表型乳腺癌组织相比,CD44~+/CD24~-表型乳腺癌组织中HOTTIP特异高表达。(3)QRT-PCR结果显示与乳腺癌亲代细胞比,球囊干细胞中HOTTIP表达显著升高。2、HOTTP调控BCSCs的自我更新能力,参与干性维持。(1)干扰HOTTIP的表达后,CD44~+CD24~-干细胞的比例明显下降;细胞球囊形成能力明显降低;干性相关蛋白OCT4和SOX2表达显著降低,而分化蛋白CK14和CK18表达明显升高。在裸鼠移植瘤实验中,HOTTIP敲低组肿瘤生长速度明显减慢。(2)过表达HOTTIP后,细胞克隆形成能力明显升高;干性相关蛋白OCT4和SOX2表达显著升高,而分化蛋白CK14和CK18表达明显降低。3、Mi R-148a-3p在乳腺癌中低表达,并通过靶向抑制WNT1调控BCSCs干性。(1)ISH结果提示miR-148a-3p在乳腺癌中低表达。且分析患者预后资料发现miR-148a低表达组患者预后较差。(2)MiR-148a-3p与BCSCs干性CD44~+/CD24~-表型负相关。(3)分析乳腺癌中miR-148a-3p和WNT1表达,发现mi R-148a-3p和WNT1表达明显负相关。(4)qRT-PCR结果显示,miR-148a-3p在乳腺癌球囊干细胞中低表达。功能实验证明miR-148a-3p可通过抑制WNT1参与调节BCSCs的干性。4、HOTTIP通过miR-148a-3p/wnt1通路参与BCSCs的干性维持。(1)HOTTIP表达与miR-148a-3p表达呈负相关关系。(2)在乳腺癌组织中,HOTTIP与WNT1表达呈正相关关系。(3)双荧光素酶报告基因实验结果表明HOTTIP可与miR-148a-3p直接结合。(4)恢复实验证实HOTTIP可通过miR-148a-3p/WNT11通路调控BCSCs的干性。结论:1、HOTTIP在乳腺癌组织中高表达且与预后不良相关。2、HOTTIP在BCSCs中高表达,参与BCSCs的干性维持,促进细胞在裸鼠体内的成瘤能力。3、MiR-148a-3p在BCSCs中低表达,可以通过抑制WNT1调控BCSCs的干性。4、HOTTIP与miR-148a表达负相关,且与WNT1表达正相关。提示HOTTIP可能通过调控miR-148a-3p/WNT1通路参与BCSCs的干性维持。