苦荞麦被誉为“五谷之王”,是集营养、保健、医疗于一身的药食同源植物,在中国具有悠久的入药历史。苦荞麦富含多种营养成分,尤其是种子中富含的黄酮类化合物芦丁、槲皮素、酚类等具有降血糖、降血脂、降血压以及抗氧化、抗衰老、抗癌防癌、改善血管微循环等多种功效。相关的研究主要集中在苦荞麦黄酮类成分的分离、纯化与分析方面,而在黄酮类代谢途径调控机理方面还没有深入的研究。苦荞麦的活性成分是黄酮类代谢途径中的重要产物,其分子机制还不是很清楚。MYB家族广泛参与到黄酮类次生代谢途径中,本研究基于苦荞麦转录组数据结合同源比对,挖掘出苦荞黄酮类代谢途径中重要MYB转录因子基因,并对其进行表达分析和功能验证。以期揭示MYB转录因子与黄酮类合成途径在次生代谢调控层面上的分子机制,为黄酮类有效成分的合成机制的阐明提供理论基础。本研究取得如下结果:1.苦荞麦MYB转录因子家族的生物信息学分析本研究通过苦荞麦的基因组和转录组数据库,结合生物信息学手段共鉴定出162个含MYB结构域的蛋白序列,其中整理得到152个R2R3-MYB subfamily、5 个 3R-MYB subfamily、5 个 4R-MYB subfamily。其中 R2R3-MYB 型的家族数目最多进一步可划分为25个subgroup(S1-S25)亚族和40个Unclassified。相关MYB蛋白功能研究表明,与黄酮类生物合成途径相关的转录因子蛋白主要集中在 S4、S5、S6、S7 几个 subgroup 中。2.黄酮类合成代谢调控基因的筛选、克隆与分析本研究首先采用同源类比、RNA-seq、光诱导处理等方法筛选出苦荞中与黄酮类合成代谢相关的MYB基因,再对候选基因进行克隆和分子验证,最终克隆得到 5 个基因:FtMYB45、FtMYB64、FtMYB102、FtMYB116、FtMYB162。对所克隆的MYB基因在苦荞麦各发育时期各组织器官中的表达量进行实时定量PCR分析,确认MYB基因的表达模式为组织差异表达。3.黄酮类合成代谢调控基因的功能验证本研究采用Gateway克隆技术成功将5个目的基因构建到pK7WG2D终表达载体上,并转入到本源植物苦荞麦和模式植物烟草中,成功获得了 3个转基因苦荞麦毛状根株系和2个转基因烟草植株。然后对转基因材料进行分子与化学检测,实时荧光定量PCR检测结果显示:目标基因(FtMYB102、FtMYB116)在转基因材料中的相对表达量有显著上调;转基因材料中黄酮类成分的检测结果显示:芦丁、槲皮素、儿茶素、表儿茶素的含量都有一定程度的上调。分子与化学的检测结果呈现出正相关趋势,初步推断FtMYB102、FtMYB116都在黄酮类代谢途径中发挥正调控作用,FtMYB102对黄酮醇代谢路径有促进效果,FtMYB1 16对原花青素代谢路径和黄酮醇代谢路径都有促进效果。