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甲型流感病毒(Influenza A Virus,IAV)属于正黏病毒科(Orthomy xoviridae),是引起上呼吸道感染的主要病原体。全球每年病死于季节性流感的患者高达50万。由于人群对新的流感病毒亚型缺乏免疫力,2009年流感大流行导致约60万人丧生。新亚型如H5N1和H7N9等一直是引起流感大流行的的重要隐患。高致病性禽流感病毒感染家禽可引起较高的病死率,严重危害养殖业的发展。甲型流感不时造成流行或大流行,不仅给畜禽养殖业造成重大的经济损失,而且对人类健康构成严重威胁。流感的急性发病期的表征以急性呼吸窘迫综合征为主,呼吸道内肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的天然屏障受到攻击和破坏是引起急性呼吸窘迫综合征的主要原因。屏障受损后导致肺泡通透性增加,肺泡内发生蛋白质样积液和水肿,其内容物含有纤维素、红细胞和炎性细胞。肺泡水肿和内容物的聚积导致气体交换障碍和呼吸困难。肺组织的病理变化进一步加剧,诱发病毒性肺炎和继发细菌感染,最后导致多器官功能衰竭及病人死亡。紧密连接(Tight Junction,TJ)是上皮细胞之间的一种重要的连接复合体,起着细胞旁通透屏障和维持细胞极性的作用,阻止溶质和水等大分子物质自由通过上皮间隙同时也阻止细菌和病毒等微生物的进入。紧密连接的组装、分解和维持由多种的细胞信号通路所调控,在这些信号分子中Shh信号通路中转录因子Gli1通过转录调控紧密连接蛋白的表达。另外泛素连接酶Itch可通过翻译后调控相关紧密连接蛋白的降解。肿瘤领域研究发现MAPK和PI3K信号通路交叉激活转录因子Gli1以及其下游的Snail转录因子。H1N1病毒激活PI3K信号通路,H5N1病毒不能激活该信号通路。这些信号通路是否参与流感病毒破坏细胞间的紧密连接结构仍不清楚;紧密连接结构在H1N1和H5N1病毒侵袭过程中的分子机制未有报道。本研究拟以流感病毒感染肺上皮细胞(A549)和C57BL/6小鼠为模型,探究IAV破坏肺泡上皮紧密连接结构,增加肺上皮细胞通透性的分子机制。H1N1病毒破坏肺上皮紧密连接结构的机制研究本部分试验研究IAV H1N1 PR8和CA09毒株破坏肺泡上皮紧密连接结构的分子机制。Western blot结果显示,H1N1 PR8和CA04毒株感染A549细胞均能够增加转录因子Gli1、Snail和Slug的蛋白表达,抑制紧密连接蛋白E-cadherin、Occludin和ZO-1的表达。免疫荧光试验结果表明H1N1 PR8毒株增强转录因子Gli1和Snail在细胞核中的定位,破坏紧密连接蛋白Occludin和ZO-1在细胞膜上的分布。荧光素酶试验结果显示,H1N1病毒增强Gli1基因启动子的活性。qRT-PCR结果显示,流感H1N1 PR8毒株感染A549细胞中Gli mRNA的表达水平显著增加。为了研究转录因子Gli1是否调控紧密连接蛋白,加入Gli1抑制剂GANT61显著逆转H1N1病毒诱导的紧密连接蛋白降解。免疫荧光试验显示,加入GANT61明显恢复紧密连接蛋白Occludin和ZO-1在细胞膜上表达。跨膜电阻试验结果显示,GANT61明显减少H1N1引起的肺上皮细胞跨膜电阻值的降低。H1N1病毒感染肺上皮细胞导致ERK和AKT的磷酸化水平显著增加,加入ERK和AKT的抑制剂U0126和LY294002阻止H1N1病毒降低紧密连接蛋白,恢复紧密连接蛋白Occludin和ZO-1在细胞膜上的表达,阻止H1N1病毒引起的肺上皮细胞电阻值的降低。体内试验结果表明H1N1 PR8毒株感染C57/B6小鼠显著增加转录因子Gli1和Snail的表达,增加ERK和AKT的磷酸化水平,抑制紧密连接蛋白的表达。GANT61治疗则阻断H1N1诱导的转录因子Gli1和Snail的上调,恢复紧密连接蛋白的表达,小鼠的肺损伤程度明显好转。这些结果表明H1N1病毒通过PI3K和MAPK信号通路激活转录因子Gli1和Snail,抑制紧密连接蛋白的表达,增加肺上皮细胞间的通透性。H5N1病毒破坏肺上皮紧密连接结构的机制研究为研究H5N1病毒破坏肺上皮紧密连接结构的分子机制,同样采用了 A549和MDCK细胞的体外试验。Western blot结果显示,H5N1病毒感染A549和MDCK细胞没有诱导反而抑制转录因子Gli1和Snail的蛋白表达,同时H5N1病毒抑制紧密连接蛋白E-cadherin、Occludin、Claudin-1和ZO-1的表达。H5N1病毒感染显著增加ERK、p38和TAK1的磷酸化水平,加入ERK、p38和TAK1的抑制剂U0126、SB202190和5Z-7-oxozeaenol显著抑制ERK、p38和TAK1的磷酸化水平,恢复H5N1病毒降低的紧密连接蛋白。免疫荧光试验结果显示,加入这些抑制剂显著恢复恢复紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1在细胞膜上的分布。敲除TAK1显著恢复H5N1病毒降解的紧密连接蛋白。跨膜电阻试验结果显示,U0126、SB202190和5Z-7-oxozeaenol显著减少H5N1引起的肺上皮细胞跨膜电阻值的降低。H5N1病毒感染增强E3泛素连接酶体Itch的表达,加入蛋白酶体抑制剂MG132恢复紧密连接蛋白的表达。免疫共沉淀结果显示,H5N1病毒感染增强Occludin蛋白的泛素化降解,抑制剂SB202190和5Z-7-oxozeaenol抑制H5N1病毒诱导的Occludin蛋白的泛素化降解。敲除Itch也显著抑制H5N1病毒诱导的Occludin蛋白的泛素化降解。体内试验结果表明H5N1感染C57/B6小鼠显著抑制转录因子Gli1和Snail的表达,增加ERK和TAK1的磷酸化水平,增加Itch的表达,抑制紧密连接蛋白的表达。5Z-7-oxozeaenol治疗恢复紧密连接蛋白的表达,小鼠的肺损伤程度明显好转。本部分实验结果表明,H5N1病毒通过激活TAK1下游的ERK和p38 MAPK信号通路诱导E3泛素连接酶Itch的表达,促进紧密连接蛋白的降解。本研究首次发现泛素-蛋白酶体系统可能参与H5N1病毒引起的肺泡上皮紧密连接结构损伤。揭示E3泛素连接酶Itch可能是抗病毒研究的潜在靶标。综上所述,H1N1病毒通过PI-3和MAP激酶信号通路诱导转录因子Gli1和Snail的表达,在转录水平上抑制紧密连接蛋白的表达增加肺上皮细胞间的通透性;与H1N1病毒的结果相反,H5N1病毒抑制转录因子Gli1和Snail的表达,但H5N1病毒激活TAK1和MAPK诱导泛素连接酶Itch的表达,促进紧密连接蛋白泛素化修饰和蛋白降解。