背景结肠癌是一种常见的恶性肿瘤,在我国,近几年结肠癌成为发病率上升最快的癌症之一。尽管近年来结肠癌的治疗水平有了很大的提高,但是其五年生存率仍徘徊在30-66%之间,没有明显提高。化疗是结肠癌治疗的一个重要步骤,但化疗耐药及其毒副作用却限制了其疗效的进一步提高。原因之一是这些药物的作用靶点都是位于凋亡级联反应的上游或中游,凋亡级联系统下游的执行蛋白仍有可能受其他信号通路的影响而抵抗细胞凋亡的执行。因此寻求一种能特异性诱导肿瘤细胞凋亡且毒副作用小的靶向药物已成为研究热点。分子靶向治疗就是针对肿瘤发生、发展过程中的关键大分子,包括参与肿瘤发生、发展过程中的细胞信号传导和其他生物学途径的重要靶点,通过特异性阻断肿瘤细胞的信号传导,来控制其基因表达和改变生物学行为,或是通过阻断肿瘤血管生成,从而抑制肿瘤细胞的生长和增殖,发挥抗肿瘤作用。相对于手术、放疗、化疗三大传统治疗手段,分子靶向治疗具有较好的分子选择性,能高效并选择性地杀伤肿瘤细胞,减少对正常组织的损伤。半胱天冬酶原活化复合物-1(procaspase-activating compound-1,PAC-1)是美国伊利诺伊大学P.J.Hergenrother教授领导的研究小组通过筛选25000多种物质后发现的一种小分子复合物,它能高效活化半胱天冬酶原-3(procaspase-3)转化为半胱天冬酶(caspase-3),而后者是细胞凋亡通路下游的凋亡执行关键蛋白,进而诱导多种肿瘤细胞产生凋亡。低分子柑桔果胶是从天然果胶产物中提取得到的一种以半乳糖为主要成份的多糖,研究发现低分子柑桔果胶是体内半乳糖凝集素-3(Galectin-3)配体的竞争性抑制剂,它与Bcl-2有明显的序列相似性,在羧基端都含有NWGR基序,而该基序是Bcl-2抑制凋亡所必需的。Bcl-2抑制凋亡的癌基因,作用于内源性细胞凋亡信号通路。虽然既往的研究已经证实PAC-1和低分子柑桔果胶可以通过作用于不同的细胞凋亡的关键蛋白或关键途径发挥抗肿瘤作用,但两者联合应用是否能够具有更强的促进凋亡、抗肿瘤作用,它们对结肠癌细胞的作用及其机理如何,目前国内外尚未见文献报道。根据:caspase-3是凋亡通路下游的执行蛋白,Bcl-2通过调节内源性细胞凋亡通路上游的Cyt-c的释放来调控细胞凋亡,我们推测PAC-1联合低分子柑桔果胶可以通过直接活化caspase-3诱导细胞凋亡及抑制Bcl-2的活性从而提高内源性细胞凋亡通路活性两方面来提高对肿瘤细胞的杀伤作用。实验目的本实验采用PAC-1和低分子柑桔果胶,通过体外实验进行以下研究:1)PAC-1和低分子柑桔果胶对人结肠癌细胞增殖及凋亡的影响,进一步从caspase-3、8、9、PARP及bcl-2的表达和细胞周期深入探讨其抗肿瘤的机制;2)明确PAC-1联合低分子柑桔果胶对人结肠癌细胞增殖及凋亡的影响并探索其内在机制。方法1、细胞株:人结肠癌细胞株SW116、HCT116、HT-29、SW620和SW480。2、MTT比色法评价不同浓度PAC-1/低分子柑桔果胶处理上述细胞72h后对上述人结肠癌细胞的体外增殖抑制作用,并计算PAC-1/低分子柑桔果胶对上述人结肠癌细胞的IC50,选出对PAC-1敏感和不敏感的细胞各一株。3、MTT比色法评价IC25、IC50、IC75剂量的PAC-1联合5mg/ml剂量的低分子柑橘果胶能否提高对PAC-1敏感和不敏感的细胞株的增殖抑制作用。4、显微镜观察不同浓度PAC-1处理后上述人结肠癌细胞的形态学变化。5、流式细胞仪检测不同浓度PAC-1对敏感和不敏感的细胞株处理后凋亡细胞比例及细胞周期的变化;IC50剂量的PAC-1对敏感和不敏感的细胞株处理不同时间后凋亡细胞比例及细胞周期的变化;IC50剂量的PAC-1联合5mg/ml剂量的低分子柑橘果胶对敏感和不敏感的细胞株处理后凋亡细胞比例及细胞周期的变化。6、Western bloting检测IC50剂量的PAC-1单用及联合5mg/ml剂量的低分子柑橘果胶对敏感和不敏感的细胞株处理后,凋亡关键蛋白caspase-3、8、9、PARP、Rock-1、bcl-2的蛋白表达水平的变化。7、采用统计学软件SPSS13.0进行统计学分析,两组间均数比较实用两独立样本t检验方差;多组间均数比较使用单因素方差分析法,如方差齐用LDS法,方差不齐,用Dunnett-t检验方法进行两两比较。以P<0.05为具有显著性差异。所有计量资料以x±s表示。结果1、PAC-1对5种人结肠癌细胞株在体外均有明显的增殖抑制作用,且成剂量依赖。各细胞株对PAC-1的IC50分别是:SW116:22.75±8.70umol/L、HCT116:2.98±1.08 umol/L、HT-29:11.27±2.24 umol/L、SW620 :3.65±0.21 umol/L和SW480:4.08±1.12 umol/L,其中以SW116最不敏感,HCT116最敏感。因高浓度的低分子柑橘果胶的无法溶解,故MTT实验无法顺利完成。2、选择对PAC-1的细胞增殖抑制作用不敏感的细胞SW116和较敏感的细胞SW620,进行下一步实验。3、因高浓度的低分子柑橘果胶无法溶解,因此联合作用低分子柑橘果胶选择细胞增殖抑制作用约50%、可几乎完全溶解的浓度5mg/ml;联合IC25、IC50、IC75剂量的PAC-1作用于SW116和SW620细胞(SW116:IC25≈1/4IC50, IC75≈4 IC50;SW620:IC25≈1/3IC50, IC75≈3 IC50)CI值分别为:IC25的PAC-1+5mg/ml的低分子柑橘果胶: 1.54638;IC50的PAC-1+5mg/ml的低分子柑橘果胶:0.57996;IC75的PAC-1+5mg/ml的低分子柑橘果胶:0.80478。低浓度的PAC-1与低分子柑橘果胶联合起拮抗作用CI>1;中、高浓度的PAC-1与低分子柑橘果胶联合起协同作用CI<1,其中以中浓度的PAC-1联合低分子柑橘果胶对结肠癌细胞的增殖抑制作用最好。4、显微镜观察不同浓度PAC-1对SW116和SW620细胞处理2h后开始出现细胞形态学改变,且随时间和浓度增加细胞出现的凋亡特征越明显,如染色质的凝聚、细胞膜起泡、细胞核断裂以及相关凋亡小体的出现。此结果与MTT实验结果相符。5、采用流式细胞仪检测IC25、IC50、IC75剂量的PAC-1作用于SW116和SW620细胞4、8、24、48h后,流式细胞仪测定凋亡细胞比例发现:IC25的PAC-1处理后4h凋亡细胞比例与空白对照组相比无显著性增加(P>0.05),当浓度增至IC50或IC75时凋亡细胞比例较空白对照组显著增加无统计学意义(P>0.05)。6、采用流式细胞仪检测IC25、IC50、IC75剂量的PAC-1联合5mg/ml的低分子柑橘果胶作用于SW116和SW620细胞4、8、24、48h后,流式细胞仪测定凋亡细胞比例发现:与PAC-1单药相比,相同时间联合用药能显著增加细胞凋亡比例,无统计学意义(P>0.05)。7、PAC-1单用及联合低分子柑橘果胶可诱导G0/G1期细胞增加,G2/M期细胞减少,产生细胞周期阻滞,具有时间和浓度依赖性。8、应用Western bloting方法检测IC25、IC50、IC75剂量的PAC-1作用于SW116和SW620细胞4、8、24、48h后,凋亡关键蛋白caspase-3、8、9、PARP、bcl-2的蛋白表达水平的情况,发现:随时间和浓度增加,caspase-3、8、9、PARP的表达呈逐渐增高趋势,bcl-2的表达无明显变化。9、应用Western bloting方法检测IC25、IC50、IC75剂量的PAC-1联合5mg/ml的低分子柑橘果胶作用于SW116和SW620细胞4、8、24、48h后凋亡关键蛋白caspase-3、8、9、PARP、bcl-2的蛋白表达水平的情况,发现:与PAC-1单药相比,联合用药后caspase-3、8、9、PARP上调、bcl-2下调的趋势更明显。结论1、PAC-1对5种人结肠癌细胞均有明显的诱导凋亡和增殖抑制作用。2、低浓度PAC-1联合低分子柑橘果胶对人结肠癌细胞的增殖和凋亡有拮抗作用;中、高浓度PAC-1联合低分子柑橘果胶对人结肠癌细胞增殖和凋亡表现为协同作用,以中浓度PAC-1联合低分子柑橘果胶的协同作用效果最佳。3、PAC-1单用及联合低分子柑橘果胶能显著增加caspase-3的活化和PARP的裂解,对caspase-8、9的活化作用不明显,表明PAC-1是直接高效活化细胞凋亡通路下游的凋亡关键执行蛋白caspase-3;联合用药对caspase-9的活化作用优于PAC-1单用,Bax/bcl-2的比值也明显升高,表明线粒体途径是PAC-1联合低分子柑橘果胶诱导人结肠癌细胞凋亡的机制。4、PAC-1单用及联合低分子柑橘果胶可延长细胞的增殖周期。