植物体细胞胚发生(Somatic Embryogenesis, SE)是指在离体条件下植物体细胞通过与合子胚发生类似的途径形成类似合子胚结构的过程。SE重演着合子胚形态发生(zygotic embryogenesis)的特性,同时可在体外进行人为操作,因而可作为植物发育生物学研究的良好模型。胚性愈伤组织是植物离体培养再生体系中常用的活体材料,可通过体细胞胚发生途径进而发育成完整的植株。在培养过程中其体细胞胚发生能力会逐渐降低甚至丧失(如柑橘类的温州蜜柑品种“国庆1号”),从而给植物组织培养、离体保存和生物技术遗传改良造成严重障碍。近来,有报道指出水稻胚性愈伤组织表达了一系列特异的micro RNAs,推测microRNA在体细胞胚发生中起重要作用。本实验室前期研究也发现一些在柑橘体细胞胚发生过程中特异表达的micro RNAs,其中Csi-miR390在球形胚阶段大量表达,Csi-miR156在生胚诱导过程中上调表达,推测它们可能在柑橘体细胞胚发生过程中发挥着重要作用。本研究拟通过构建Csi-miR390,156的超量表达载体,转化胚性丧失的国庆一号(Citrus unshiu)愈伤组织,以揭示其在柑橘体细胞胚发生过程中的作用机制,主要研究结果如下：1.从伏令夏橙胚性愈伤组织中扩增包含miRNA前体的Csi-MIR390、156片段,该品种的愈伤组织经27年保存仍具有很强的体胚发生能力。扩增到的序列与本实验室前期从甜橙EST中预测到的前体序列具有较高的同源性,而与拟南芥miR390、156前体基因序列无同源性,但它们产生的成熟microRNA序列一样。2.构建了Csi-miR390,156的超量表达载体(OX-C390、156)并以根癌农杆菌介导的方法对胚性丧失的“国庆1号”(C. unshiu)愈伤组织进行了遗传转化。通过筛选培养和GUS染色及PCR鉴定,共获得6个Csi-miR390转基因阳性愈伤组织系；10个Csi-miR156转基因阳性愈伤组织系；7个转空载体pCAMBIA13011阳性愈伤组织系。3.对所有转基因阳性愈伤组织系进行实时荧光定量PCR及茎环反转录实时荧光定量PCR检测,获得3个Csi-miR390超量表达愈伤组织系和2个Csi-miR156超量表达的愈伤组织系。4.将获得的超表达愈伤组织系在4种不同糖源MT培养基上进行体细胞胚诱导,发现糖源的改变并不能引起超表达愈伤组织系表型的变化,即不能诱导生胚；但透射电镜观察显示Csi-miR390、156超表达愈伤组织系的细胞超微结构变化与前人胚性愈伤组织超微结构观察结果相似,表明Csi-miR390、156对柑橘愈伤组织胚性的恢复可能起到了一定的促进作用。