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背景前列腺癌是欧美国家最常见的男性恶性肿瘤之一,占男性癌症死因的第二位。在我国,近年来随着人口老龄化及生活饮食习惯的改变,前列腺癌发病率呈逐年增长趋势。前列腺癌生长进展呈激素依赖性,绝大多数晚期前列腺癌采用雄激素剥夺治疗,初期可获得满意疗效,但经过一定时间的雄激素剥夺治疗后几乎所有前列腺癌将转变为激素非依赖性前列腺癌(androgen-independent prostate cancer, AIPC)。AIPC的形成机制目前尚未阐明,缺乏有效治疗手段,预后较差。肿瘤免疫治疗作为现代肿瘤治疗的重要方法之一,越来越受到关注。近年来,在前列腺癌免疫治疗方面的研究,主要包括细胞因子、单克隆抗体、肿瘤相关抗原免疫靶向治疗、树突状细胞免疫治疗和肿瘤疫苗等,但有研究证实在前列腺癌局部微环境中肿瘤特异性淋巴细胞可被快速诱导至免疫耐受状态,因此不扭转免疫逃逸和免疫耐受状态,单纯通过各种方法来增加肿瘤细胞抗原性和特异性淋巴细胞活性,并不能起到理想的抗肿瘤作用。值得关注的是近年来的研究表明沉默淋巴细胞的cbl-b基因可能可以克服这些困难。Cbl-b (Casitas B-cell lineage lymphoma-b)属Cbl家族成员,是淋巴细胞的一个负调控分子,对调控外周T细胞起关键作用。cbl-b基因缺陷可以在缺乏协同刺激配体的情况下直接活化CTL,同时可以使T细胞对于TGF-β等抑制性细胞因子及Treg等抑制作用的敏感性降低,从而克服肿瘤诱导的免疫耐受。研究发现在自发性淋巴瘤小鼠模型中敲除cbl-b基因,能够有效降低肿瘤发生率,并使已经发生的肿瘤消退。目前,国内外尚无通过抑制淋巴细胞cbl-b基因的表达,来提高前列腺癌免疫治疗效果的相关报道。研究目的本课题拟通过小鼠cbl-b特异性的siRNA沉默淋巴细胞cbl-b基因,检测淋巴细胞活化状态及细胞因子表达情况的改变,并考察cbl-b基因沉默的淋巴细胞对鼠前列腺癌RM-1细胞的杀伤作用,以了解沉默淋巴细胞cbl-b基因对前列腺癌抗肿瘤免疫的影响,为激素非依赖前列腺癌的免疫治疗提供理论基础,在前列腺癌免疫逃逸机制上作进一步探讨。研究方法1、采用siRNA的在线设计软件设计针对鼠cbl-b基因的特异性siRNA序列,通过基因组数据库进行比对以确保序列的高度特异性。构建重组表达质粒,采用包含绿色荧光蛋白的慢病毒载体系统质粒,选择转染293T平台细胞,并运用Westernblot在蛋白水平检测对Cbl-b抑制率。2、获取健康C57小鼠新鲜脾脏,通过梯度离心取得单个核细胞进行培养。以包含cbl-b特异性siRNA的慢病毒转染培养的淋巴细胞。将培养的淋巴细胞分为三组,对照组为未经处理的C57小鼠脾脏分离淋巴细胞,空转组为转染空载体病毒的淋巴细胞,实验组为转染cbl-b特异性siRNA慢病毒载体的淋巴细胞。通过流式细胞仪检测淋巴细胞表面活化分子CD69。通过酶联免疫吸附法检测IL-2和INF-γ的分泌。通过CCK8法检测淋巴细胞增殖情况。3、小鼠前列腺癌RM-1细胞,培养于不含雄激素的10%小牛血清IMDM培养液中。选取生长良好的RM-1细胞,分别加入未经处理的淋巴细胞、转染cbl-b特异性siRNA慢病毒载体的淋巴细胞,混合培养。以RM-1鼠前列腺癌细胞株为靶细胞,进行CCK8实验检测各组淋巴细胞的肿瘤细胞杀伤活性。按同样分组,分别加入TGF-β抑制后,进行CCK8实验检测淋巴细胞杀伤活性变化。结果1、本研究针对cbl-b基因序列设计了4个不同位点的cbl-b特异性siRNA序列,成功构建了重组表达质粒,通过荧光显微镜观察可见90%细胞呈现荧光,提示目的基因已经转入靶细胞。Western blot结果显示,2号靶点的cbl-b特异性siRNA对cbl-b基因的敲减作用最为显著,Cbl-b蛋白表达抑制率达到93.4%,因而是最佳靶点。逐孔稀释法检测病毒滴度,结果显示获取病毒滴度约为2E+7TU/mL,可用于下一步实验沉默cbl-b基因表达研究。RT-PCR检测结果显示慢病毒载体滴度值>2.00E+7TU/ml,与逐孔稀释法检测病毒滴度相符,可用于后续实验。2、以C57小鼠脾脏成功获取单个核细胞进行培养,培养第七天增殖最强,呈集群生长,易搅拌成单个游离细胞。慢病毒载体转染淋巴细胞转染率达92%, Western blot结果显示淋巴细胞Cbl-b蛋白抑制率达89.4%。流式细胞仪检测淋巴细胞表面活化标志CD69,在转染cbl-b特异性siRNA慢病毒的淋巴细胞明显高于对照组(P<0.01)。ELISA检测细胞因子IL-2和1NF-γ的分泌,转染组淋巴细胞明显高于对照组(P<0.05)。3、应用CCK8试剂盒测定各组淋巴细胞对RM-1前列腺癌细胞的体外杀伤作用,实验结果显示：转染cbl-b特异性siRNA后淋巴细胞对靶细胞在比率为40：1时,具有最强的杀伤活性(杀伤率为40.98%),比对照显著增强(P<0.05)。加入TGF-β后,转染cbl-b特异性siRNA的淋巴细胞对RM-1细胞的杀伤活性无明显抑制。结论1、本研究构建的cbl-b特异性siRNA重组表达质粒慢病毒载体,能够有效抑制淋巴细胞cbl-b基因表达,达到cbl-b基因沉默的目的。2、cbl-b特异性siRNA转染的淋巴细胞其细胞活化明显增强,细胞因子IL-2和INF-γ的分泌明显增加,提示Cbl-b对外周淋巴细胞的负性调控作用受到抑制,淋巴细胞活性增强。3、cbl-b特异性siRNA转染的淋巴细胞其对前列腺癌细胞的杀伤活性明显增强,并不受TGF-β的抑制。提示cbl-b基因沉默的淋巴细胞有更强的抗肿瘤作用,在治疗前列腺癌方面可能是一种有效的工具,为解决前列腺癌免疫治疗中的免疫耐受和免疫沉默提供了有力的依据,为寻找到AIPC可能的新的免疫治疗方法提出了一定的实验和理论基础。